摘要
2019年冠狀病毒?。–OVID-19）是由嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）引起的以飛沫和接觸為主要傳播途徑的傳染病。自2019年12月中國武漢出現(xiàn)首例病例以來，疫情逐漸向全國蔓延。截至目前，根據(jù)中國衛(wèi)計委官方公布的數(shù)據(jù)，新確診患者人數(shù)不斷下降，疫情逐漸得到控制。雖然大部分患者感染后癥狀較輕，預(yù)后良好，但也有部分患者發(fā)展為嚴重，多器官并發(fā)癥而死亡。人類感染SARS-CoV-2的發(fā)病機制尚不清楚。免疫功能是抵抗入侵病原體的強大防御手段，目前尚無特異性的抗病毒藥物。本文綜述了SARS、MERS等冠狀病毒肺炎類似SARS-CoV-2的免疫學變化。結(jié)合已發(fā)表的文獻，推斷出COVID-19的潛在發(fā)病機制，并提出對重癥型患者給予大劑量靜脈注射免疫球蛋白和低分子量肝素抗凝治療的治療建議。
繼2003年嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)[1]、沙特阿拉伯和韓國南部爆發(fā)中東呼吸綜合征(MERS-CoV)后，冠狀病毒(CoV)再次成為熱點[2]，自湖北省武漢市發(fā)生新的冠狀病毒并迅速蔓延至全中國等30多個國家以來，冠狀病毒(CoV)再次成為熱點。截至目前（2020年2月25日），已確診感染者約80萬例，造成2500例以上死亡[3]，急需盡早進行病毒感染的鑒別和干預(yù)。雖然核酸檢測在病毒基因組序列檢測中發(fā)揮了最大的作用[4]，但由于核酸檢測的過度敏感和對采樣的依賴性，在臨床上可能會出現(xiàn)一定程度的假陽性或假陰性。盡管對實用的治療方法或任何可能的藥物都進行了多種類型的研究，但目前的共識是沒有推薦任何抗病毒藥物[5]。目前已證實，免疫系統(tǒng)在防御SARS-CoV和MERS感染中發(fā)揮了重要作用。觀察SARS[6]、MERS[7]和流感[8]患者的免疫變化，尤其是外周血T淋巴細胞亞群的變化，有助于了解該病的特點、診斷、監(jiān)測、預(yù)防和治療。
1. SARS的免疫變化
在SARS-CoV感染的急性期，外周血中的淋巴細胞迅速減少[6]，主要是T淋巴細胞減少，CD4+和CD8+ T淋巴細胞均減少。淋巴細胞的丟失甚至先于胸片上的異常變化[9,10]。SARS患者經(jīng)過1年的隨訪后，CD3+、CD4+、CD8+ T細胞在疾病恢復期迅速恢復。CD8+ T淋巴細胞，在發(fā)病后2-3個月內(nèi)恢復正常。記憶性CD4+T細胞在發(fā)病后1年內(nèi)恢復正常，而其他細胞計數(shù)包括總T淋巴細胞、CD3+細胞、CD4+細胞、CD4+細胞和幼稚CD4+T細胞等仍低于健康對照組[11]。假設(shè)病毒感染后，外周血中的淋巴細胞減少首先是由于淋巴細胞封存引起的?；謴推诹馨图毎脑黾硬皇切叵佼a(chǎn)生的新細胞，而是外周血與組織或器官之間的淋巴細胞再循環(huán)[11]。SARS特異性IgG抗體在急性期晚期約2周左右產(chǎn)生，并隨著病程的發(fā)展逐漸增加[12]。IgG的持續(xù)存在，使患者在感染后獲得免疫功能?？祻推诨颊叩腟蛋白特異性中和抗體反應(yīng)水平較高且持續(xù)存在，可能在決定疾病結(jié)局中起著重要作用[13]。輕度患者的IgG水平明顯高于重度患者。在疾病進展過程中，患者可伴有IL-8和TNF-α水平的升高，IL-8和TNF-α水平在恢復期早期達到高峰，而MCP-1在急性期早期表現(xiàn)為快速升高，隨著病情進展逐漸降低。根據(jù)上述研究結(jié)果，建議在疾病早期用低劑量糖皮質(zhì)激素治療，治療時間不超過2周，使大多數(shù)重癥患者的癥狀得到良好控制[9]。這與其他文獻中描述的大劑量糖皮質(zhì)激素的效果不同[14]。
2. MERS的免疫變化
2012年從一名患者身上分離出一種先前未知的冠狀病毒(MERS-CoV)[15]，在家庭型和醫(yī)院型的暴發(fā)疫情中造成了較高的死亡率[2]，與嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)相似。兩種病毒的基因組結(jié)構(gòu)非常相似，都是單鏈正鏈的RNA病毒，但MERS-CoV和SARS-CoV進入宿主細胞后，MERS-CoV和SARS-CoV分別附著在不同的受體二肽肽酶4(DDP4)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)上[16,17]。此外，MERS-CoV感染的臨床表現(xiàn)與SARS-CoV一樣，從無癥狀感染到重癥肺炎伴有急性呼吸窘迫綜合征、敗血性休克、多器官功能衰竭導致死亡[15]。雖然臨床發(fā)病機制尚未明確解釋，但一項回顧性研究[7]比較了韓國45例患者，認為外周淋巴細胞減少（淋巴細胞減少是指絕對淋巴細胞數(shù)低于1 000個細胞/mm3）、血小板減少（血小板數(shù)低于15萬個細胞/mm3）和CRP水平高可預(yù)測肺炎的發(fā)展和早期病程中呼吸衰竭的進展。這一結(jié)果得到了Min等[18]報道的證據(jù)支持。而值得注意的是，MERS感染中的淋巴細胞減少癥與SARS患者相比并不顯著[19]，研究發(fā)現(xiàn)除免疫抑制狀態(tài)和并發(fā)感染外，年齡是唯一的預(yù)測因素[20]。
關(guān)于MERS-CoV的T細胞反應(yīng)，在癥狀發(fā)生后兩周內(nèi)（急性期），除了白細胞介素(IL)-6和C-X-C動機趨化因子(CXCL)-8等促炎性細胞因子/趨化因子分泌外[21,22]，在重癥/中度患者中觀察到MERS-CoV反應(yīng)性CD8+ T細胞的頻率較高，在檢測到體液和CD4+ T細胞反應(yīng)之前，MERS-CoV反應(yīng)性CD8+ T細胞的頻率較高。在恢復期，CD8+ T細胞反應(yīng)的幅度沒有顯著增強[22]。這一結(jié)果表明，對入侵的MERS-CoV的低效控制帶來了強健的炎癥反應(yīng)和CTL反應(yīng)，而CTL反應(yīng)在清除病毒中發(fā)揮了重要作用。此外，發(fā)病后第24天獲得的PBMCs顯示出對MERS-CoV S蛋白的強特異性T細胞反應(yīng)[23]。細胞毒性T淋巴細胞（CTL）保護MHV（與SARS-CoV和MERS-CoV同屬β冠狀病毒組成員）病毒清除的作用也在動物實驗?zāi)Ｐ椭械玫阶C實[24]。
Zhao, J等[25]發(fā)現(xiàn)，在恢復期，體外測定的中和(PRNT50)抗體滴度可預(yù)測感染小鼠的血清保護能力，并與CD4+ T細胞反應(yīng)相關(guān)，但與CD4+ T細胞反應(yīng)無關(guān)。而且在他們的實驗中，CD4+ T細胞的表型為效應(yīng)記憶（CD45RA-CCR7-）細胞，而病毒特異性的CD8+ T細胞種群為半數(shù)效應(yīng)記憶（CD45RA-CCR7-）細胞和半數(shù)CD45RA+CCR7-細胞。MERS患者在癥狀發(fā)生后持續(xù)和逐漸增加的淋巴細胞反應(yīng)可能是對抗MERS-CoV的有效免疫反應(yīng)所需要的，但CTL的周轉(zhuǎn)和這些細胞提供的效應(yīng)是什么，仍需要進一步研究。
3.?流感中的免疫變化
不同于MERS和SARS的消失，2009年的流感大流行（H1N1）已被納入季節(jié)性菌株。然而，相對于甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）而言，H1N1流感大流行的病死率相對較高[26]，而甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）通常被納入季節(jié)性菌株中[27]。流感基因組包含8個片段，具有抗原漂移和移位兩種能力，可分別進行小核苷酸突變和基因組片段交換。由于這些特點，新型抗原在人類中從未出現(xiàn)過，使季節(jié)性流行病的發(fā)生成為可能。
甲型H1N1感染的表現(xiàn)從亞臨床癥狀到明顯的乏力伴發(fā)熱、肌無力和鼻出血，再到急性低氧血癥和急性呼吸窘迫。肺外表現(xiàn)，如胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)和心臟功能障礙等肺外表現(xiàn)，在綜述中也有描述[26]。盡管2009年大流行的H1N1病毒感染和宿主免疫模式不完全，但在早期反應(yīng)期，血漿中IL-15、IL-8，特別是IL-6水平的升高可能是重癥的標志物[28]。另一項研究[28]映射了41名健康志愿者在感染前和感染期間對流感的T細胞反應(yīng)，并證明流感特異性CD4+ T細胞與人類流感挑戰(zhàn)的疾病保護相關(guān)。然而，Kristin G.I.Mohn等[8]在急性期和恢復期患者中刺激PBMC，提示急性期患者中流感特異性CD8+與CD4+ IFN-γ T細胞的頻率明顯低于CD4+，而康復期患者中針對保守的核心抗原的CD4+和CD8+ T細胞的水平都很高?？紤]到缺乏足夠的樣本量和研究設(shè)計，在不同的感染期是否存在T淋巴細胞亞群主導地位的差異性還需進一步探討，但CD4+ T淋巴細胞計數(shù)與疾病嚴重程度有關(guān)[28,29]。
值得注意的是，在季節(jié)性流感感染中，外周淋巴細胞計數(shù)和淋巴細胞亞群與重癥患者的預(yù)后表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。有研究將IAV或IBV患者與健康人比較，血清IL-6、IL-8水平升高，CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK計數(shù)下降與患者感染有關(guān)[30,31]。
據(jù)文獻綜述，SARS-CoV、MERS-CoV、流感病毒等呼吸道感染的病毒均引起周期性暴發(fā)和死亡。組織病理學檢查顯示共同特點：彌漫性肺泡損傷、水腫性肺部病變和肺炎[32-34]。此外，對病毒感染的檢查表明，病毒在上呼吸道和下呼吸道的有效復制能力與輕度或中度的臨床癥狀和病理改變有關(guān)[33-35]，但僅在MERS-CoV感染的獼猴中，接種后2天內(nèi)可檢測到一過性淋巴細胞減少[33]。Jiang Gu等[36]推測，明顯的T淋巴細胞（CD3+、CD4+和CD8+細胞）下降使免疫系統(tǒng)減弱，加重了呼吸道SARS感染的SARS。綜上所述，病毒復制、分布及相關(guān)免疫反應(yīng)促進了傳染病的進展。外周淋巴細胞的變化和淋巴細胞亞群的轉(zhuǎn)變可能為SARS-CoV-2感染的發(fā)病機制提供了新的思路。
4. 假設(shè)的發(fā)病機制
根據(jù)已發(fā)表的文獻和對COVID-19患者的臨床觀察，我們對SARS-CoV-2感染人類的發(fā)病機制提出了合理的假設(shè)。病毒可能通過黏膜，尤其是鼻腔和喉部黏膜，然后經(jīng)呼吸道進入肺部，再由呼吸道進入肺部。感染的早期最常見的癥狀是發(fā)熱和咳嗽[37]。病毒可由肺部進入外周血，引起病毒血癥。然后病毒會攻擊表達ACE2的靶器官，如肺、心、腎、胃腸道等[38,39]。糞便樣本中檢測到的SARS-CoV-2的可能性較大[37]，因為病毒從肺部進入血液，然后由血液進入腸道，這支持了我們的假設(shè)。王大偉等發(fā)現(xiàn)，從癥狀出現(xiàn)到ARDS的中位時間約為8天[40]。我們推測，在這種情況下，病毒開始二次侵襲，使患者在發(fā)病后7-14天左右病情加重。在感染過程中，患者早期外周血中的白細胞計數(shù)正?；蛏缘蚚37]，出現(xiàn)淋巴細胞減少癥[40]。我們推測，可能在疾病早期就會出現(xiàn)B淋巴細胞減少，從而影響患者體內(nèi)抗體的產(chǎn)生。嚴重型患者中，淋巴細胞明顯減少[40]。我們推測，COVID-19型患者的淋巴細胞可能隨著疾病的進展而逐漸減少。但重癥型患者淋巴細胞顯著減少的機制仍不清楚。此外，以IL-6為主的疾病相關(guān)的炎癥因子[41]明顯增加，這也是發(fā)病后7-14天左右病情加重的原因。非生存者的中性粒細胞、D-二聚體、血尿素氮和肌酐水平均高于生存者[40]。
根據(jù)上述假設(shè)，將臨床階段分為三個階段：病毒血癥期、急性期（肺炎期）和恢復期。如果急性期（肺炎期）患者的免疫功能有效，沒有更多的基礎(chǔ)疾病，病毒能得到有效抑制，則進入恢復期。如果患者年齡較大，或免疫功能受損，再加上其他基礎(chǔ)疾病如高血壓、糖尿病等，急性期（肺炎期）患者的免疫系統(tǒng)不能有效控制病毒，就會變成重癥或危重型。正如我們在假說中提到的，重癥型患者的T細胞、B細胞進一步減少，而炎癥細胞因子和D-二聚體繼續(xù)增加（圖1A）。為了提高患者的免疫功能，抑制炎癥因子風暴的形成，我們提出了以下兩種治療措施。
COVID-19目前沒有特異性的抗病毒藥物治療，所以本病的治療主要以對癥治療和氧療為主。建議在發(fā)病期間監(jiān)測炎癥因子和淋巴細胞亞群。我們建議在T細胞、B細胞、炎癥細胞因子和D-二聚體呈現(xiàn)以下趨勢時，可盡早給予IVIg和低分子量肝素（LMWH）抗凝治療。外周血中T淋巴細胞和B淋巴細胞較之前明顯降低；炎性細胞因子如IL-6等炎性細胞因子明顯增高；凝血指標如D-二聚體異常增高；胸部CT提示肺部病變擴大。在我們的推薦中，可按每天每公斤體重0.3-0.5g的劑量給予大劑量IVIg，連用5天，可早期阻斷炎癥因子的風暴，增強免疫功能。目前已經(jīng)啟動了一項對嚴重的SARS-CoV-2感染患者進行IVIg的隨機對照臨床試驗（NCT 04261426）。盡管IVIg在治療流感患者[42]和SARS患者中顯示出療效[43]，但我們需要更多的COVID-19患者的臨床數(shù)據(jù)作為證據(jù)。
尤其是在疾病的早期階段，建議采用LMWH抗凝治療。感染是引起播散性血管內(nèi)凝血的常見原因。炎癥、感染等因素可導致凝血功能過度激活。我們在臨床上觀察到，COVID-19重癥型患者可發(fā)生播散性血管內(nèi)凝血（DIC）（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。在COVID-19重癥型患者中，手指和腳趾可能出現(xiàn)缺血性改變（圖2）。當D-二聚體值高于正常上限4倍時，建議對COVID-19型患者進行抗凝治療，但有抗凝禁忌癥的患者除外。LMWH的推薦劑量為每公斤體重100U，每12 h皮下注射一次，至少3-5天。臨床醫(yī)生應(yīng)密切觀察患者的實驗室檢查指標，警惕抗凝劑治療后的副作用。
綜上所述，目前對COVID-19重癥型和危重型患者的治療是控制死亡人數(shù)上升的關(guān)鍵。我們建議早期啟動IVIg和LMWH抗凝治療，對改善重癥和危重型患者的預(yù)后有較好的效果。圖1B描述了啟動IVIg和LMWH抗凝治療的最佳時間，以及治療后T細胞、B細胞、炎癥細胞因子、D-二聚體的可能趨勢。需要更多的免疫學相關(guān)研究來幫助我們了解發(fā)病機制，指導疾病的治療，改善預(yù)后。
Lin, Ling, et al. "Hypothesis for potential pathogenesis of SARS-CoV-2 infection——a review of immune changes in patients with viral pneumonia."?Emerging microbes & infections?just-accepted (2020): 1-14.
