聲明：本文部分內(nèi)容和部分圖片來源于網(wǎng)絡(luò)。本文為生信小白學(xué)習(xí)筆記，不能保證專業(yè)名詞和內(nèi)容全部正確或權(quán)威。? ? ? ?
? ? ? ?下圖為某一條RNAseq從數(shù)據(jù)預(yù)處理，序列回帖到數(shù)據(jù)可視化的工作流程，包含了較多的軟件（Linux環(huán)境運行）和若干個包（R語言環(huán)境運行），本系列將按下圖，對每一個步驟進行學(xué)習(xí)和理解。
Basic Statistics
從read水平，概況fastq文件質(zhì)量。
可從文件中獲得文件名，文件類型，測試平臺的版本（Encoding），總序列數(shù)，標為質(zhì)量差的序列數(shù)，序列長度和GC占比。不同物種GC占比不同，人類為42%左右。
Per base sequence quality
? ? ? ?一種可快速分析測序質(zhì)量的方法。綠色區(qū)域的值是完全正常，黃色區(qū)域為輕度不正常，紅色區(qū)域為非常不正常。
? ? ? ?橫坐標為讀段，縱坐標為測序質(zhì)量評估。這里的Quality score=-10*lg10(error P)，20%Q表示1%的錯誤讀取率，30%為0.1%錯誤讀取率。黃色塊的上下線表示質(zhì)量25%和75%；藍色線，平均數(shù)；紅色線，中位數(shù)。
一般要求箱線圖10%的線大于Q=20。
Per tile sequence quality
縱坐標為tail的index編號。藍色表示質(zhì)量高，淺色或紅色表示質(zhì)量低。目的是分析是否特定tail受影響后質(zhì)量低。后續(xù)可針對性去除低質(zhì)量tail。
Per sequence quality scores
該圖表示總體read平均Q值的分布。橫坐標為Q值，縱坐標為read數(shù)。越多read的Q值集中在高分區(qū)，證明該樣品質(zhì)量越好。
Per base sequence content
四個堿基在讀段不同位置的百分比。橫坐標是測試堿基的位置，縱坐標為堿基百分比。
理論上，四種不同堿基百分比差別不大，若測試堿基前端不同堿基差別較大（AT或CG差別超過10%），此項檢測質(zhì)量較低?？赡艿脑蚴窃跍y試前幾個堿基時，儀器設(shè)備調(diào)整導(dǎo)致的偏差，可在后續(xù)數(shù)據(jù)預(yù)處理中，將其剪出。后段差別較大的原因可能是測試時的adapter沒有清除干凈，可在后續(xù)清除。
Per sequence GC content
該圖表示GC堿基在所有序列中的分布。紅色線表示待評估樣品中每read的GC數(shù)，越符合理論分布，表明該樣品質(zhì)量越好。如果雙峰，可能混有了其他物種的DNA序列。
Sequence Length Distribution
橫坐標為序列長度，縱坐標為序列數(shù)。在下圖中，理論上，所有序列都應(yīng)該是40 bp。
Adapter Content
檢測樣品中adapter是否被全部去除及種類。理論上，樣品中不含有adapter。從下圖中，可看出本樣品有adapter未全部去除，且剩余的是Illumina Universal Adapter
MultiQC可將數(shù)個fastQC結(jié)果整合到一個文件，方便查閱分析。
Adatpter & kmer
? ? ? ?Adapter是Illumina雙端測序時，會在待測鏈兩端加上adapter，其和flowcell上的oligo是配對的，可幫助待測序列固定在flowcell上，而primer是擴增insert部分的引物。
在Illumina雙端測序中，通用的Adapter是：
Top adapter：5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 3'
Bottom adapter：5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 3'
? ? ? ?Kmer就是指 k 長度的序列，比如GATTC就是5-mer。Kmer content圖（如下圖）分析不同k-mer的短序列出現(xiàn)的頻數(shù)。橫坐標表示短序列的長度，縱坐標表示某長度的序列在總reads中的百分比。
? ? ? ?在分析Kmer問題時，要考慮不同序列長度觀測到的出現(xiàn)頻率與預(yù)期頻率。使用圖片上端的公式計算觀測值與預(yù)測值的差異。其值高于5，會被認為over-represented。同時，fastQC也會給出kmer的統(tǒng)計報告。可得到最顯著且觀測值與預(yù)測值差異最大的kmer序列內(nèi)容。
