群落多樣性之Alpha多樣性（一）

學(xué)習(xí)生物學(xué)，一項(xiàng)很重要的事情就是理解概念。
有一種方法就是直接從名字上理解概念。
小RNA，是不是就是很小的RNA？
宏基因組，是不是就是很“宏”的基因組？
……
答案很統(tǒng)一：必須是??！

這可以總結(jié)出一套理解生物學(xué)概念的方法，就是顧名思義。
今天呢，我們繼續(xù)感受一下宏基因組中的“宏”，介紹一個(gè)廣泛應(yīng)用于宏基因組分析中的生態(tài)學(xué)概念——Alpha多樣性。先請(qǐng)看下面的BOX中的三個(gè)定義。

-----------------------------------------BOX 1：群落多樣性-----------------------------------------
微生物群落物種多樣性指標(biāo)共分為三種分別為：
Alpha多樣性：指特定群落或生境內(nèi)的物種多樣性，主要關(guān)注群落內(nèi)的物種多樣性。
Beta多樣性：是生境之間的物種多樣性，用以衡量群落之間的差別。
Gamma多樣性：在一個(gè)地區(qū)內(nèi)不同生境的總多樣性。
--------------------------------------------BOX 1 END------------------------------------------------

跟宏基因組不一樣的是，此概念不那么容易顧名思義。
什么是Alpha、Beta和Gamma多樣性？
它們有什么區(qū)別？
感覺(jué)沒(méi)那么容易搞清楚，上面字我全都認(rèn)識(shí)，連起來(lái)看我就沒(méi)怎么看明白。
史學(xué)界和法律界中都有這么個(gè)說(shuō)法，叫做“孤證不立”。
僅僅我自己沒(méi)看明白，并不足以證明此概念不好理解。
于是乎，我把此概念分享給一個(gè)執(zhí)行過(guò)宏基因組學(xué)分析的同事，然后出了道判斷題。

-------------------------------------------BOX 2：一道判斷題----------------------------------------
我?guī)е鴶z像頭去非洲大草原的3個(gè)地區(qū)拍攝，回來(lái)研究視頻，在3個(gè)地區(qū)觀察到以下動(dòng)物：
地點(diǎn)A：1頭獵豹、1頭獅子、1頭野豬，2只長(zhǎng)頸鹿，11頭野牛,15只土狼。
地點(diǎn)B：1只鬣狗、1頭獅子、2只狒狒，8條鱷魚(yú)，10頭野豬，18頭水牛。
地點(diǎn)C：3頭獵豹、1頭獅子、20匹斑馬、1條蛇、1只烏龜，10只河馬。
問(wèn)：目測(cè)一下，三個(gè)地點(diǎn)的Alpha多樣性是否是一致的？
------------------------------------------------BOX 2 END---------------------------------------------

同事的回答是：“不相等……吧?！?br>“為什么？”
“感覺(jué)吧！”
“這個(gè)感覺(jué)有點(diǎn)問(wèn)題。如果不考慮為什么的話(huà)，你這道題怎么回答都是值得商榷的！”
“alpha多樣性主要用于推測(cè)特定群落內(nèi)的多樣性，alpha多樣性的一個(gè)最簡(jiǎn)單的指標(biāo)就是數(shù)一下樣本中的物種數(shù)量，那么，三個(gè)地點(diǎn)的物種數(shù)各是多少呢？”
“都是6個(gè)！”同事有種恍然大悟的感覺(jué)，“哦，那他們的alpha多樣性是相等的啊！”
其實(shí)，就憑前面很勉強(qiáng)的回答“不相等……吧?！焙汀案杏X(jué)吧”，我基本上可以做出判斷：這哥們跟我當(dāng)年最初接觸宏基因組學(xué)的時(shí)候一樣，做過(guò)類(lèi)似的分析，但是并不完全清楚Alpha多樣性。
如此說(shuō)來(lái)，這就是不光我一個(gè)人弄不明白得問(wèn)題了，不算“孤證”了。
看來(lái)詳細(xì)點(diǎn)介紹這個(gè)概念，還是有必要的。

Alpha多樣性主要用于評(píng)估特定群落內(nèi)的多樣性。
其中一個(gè)最簡(jiǎn)單的指標(biāo)就是數(shù)一下樣本中的物種數(shù)量。
那么，三個(gè)地點(diǎn)的物種數(shù)各是多少呢？
6個(gè)，從觀察到樣本的物種數(shù)量上看，他們的Alpha多樣性是相等的。
這么簡(jiǎn)單？其實(shí)沒(méi)這么簡(jiǎn)單！
對(duì)于特定群落或生境內(nèi)的物種多樣性，最簡(jiǎn)單的理解就是，群落或生境內(nèi)看到的物種多，就是多樣性高。又由于我們進(jìn)行宏基因組學(xué)研究的時(shí)候，一般在特定群落采集一個(gè)樣本或者一組樣本（一般為3到5以上），群落或生境內(nèi)也可理解為樣本或組內(nèi)，即within sample or within group。目前，Alpha多樣性最常用的有5種指標(biāo)，即Observed Species（Obs），Chao1，ACE，Shannon和Simpson。
這五種指標(biāo)涵蓋了三大問(wèn)題。
1. 物種豐富度 (Richness)----不考慮豐度，即樣本中有多少個(gè)物種，衡量指標(biāo)包括Obs，Chao1和Ace。
2. 物種多樣性 (Diversity)----將物種個(gè)數(shù)和物種的豐度全部考慮在內(nèi)的多樣性，衡量指標(biāo)包括Shannon和Simpson。
3. 物種均勻度 (Eveness)----這些物種的豐度分布情況，衡量指標(biāo)包括Shannon和Simpson等。
這五個(gè)指標(biāo)說(shuō)的都與生境內(nèi)多樣性有關(guān)，但又各有各的不同。

Observed Species是最簡(jiǎn)單的計(jì)算方式，就是數(shù)一下這個(gè)樣本中有多少類(lèi)物種。
那么物種怎么數(shù)呢？
微生物又不能像上面說(shuō)的獅子和野豬一樣直接去數(shù)，難道要在顯微鏡下數(shù)么？
別說(shuō)這還真有可能是個(gè)好主意，也許有一天人工智能發(fā)展到一定程度，可根據(jù)形態(tài)學(xué)特征一個(gè)個(gè)數(shù)出來(lái)。
未來(lái)的事情未來(lái)再說(shuō)，先說(shuō)眼下，好在現(xiàn)在我們有高通量測(cè)序手段解決這個(gè)問(wèn)題，就是說(shuō)測(cè)完了序，數(shù)序列，推斷物種的Alpha多樣性。
數(shù)序列，其實(shí)數(shù)的就是操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units, OTU）。
OTU就是能夠標(biāo)志分類(lèi)單元（屬或物種等）的一種DNA序列。
如果想對(duì)OTU是什么怎么來(lái)的有個(gè)大概的了解，請(qǐng)看下面分割線(xiàn)中這段；如果不想，直接跳過(guò)就是。

--------------------------------------BOX 3： OTU是怎么來(lái)的--------------------------------------
以16S序列分析為例，我們從微生物DNA高變區(qū)擴(kuò)增子序列測(cè)序得到雙末端測(cè)序數(shù)據(jù)(Pair-end Reads, PE Reads)。
經(jīng)一定條件過(guò)濾后,將每對(duì)PE Reads的Read1和Read2根據(jù)重疊序列拼接成Tag序列，然后再過(guò)濾，得到Clean Tags序列。理論上，每一條Clean Tag序列來(lái)自一個(gè)菌。
再將相似度大于97%或95%的Clean Tags序列歸為同一個(gè)序列單元，這種序列單元就叫做操作分類(lèi)單元（OTU）。
實(shí)際上，OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為方便分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元設(shè)置的同一標(biāo)志，其中分類(lèi)單元可以是門(mén)、綱、目、科、屬、種、品系以及分組等。
在宏基因組研究中，一個(gè)OTU不止可能能標(biāo)志種，也可能標(biāo)志屬，還可能標(biāo)志科等不同的分類(lèi)等級(jí)，所以它叫操作分類(lèi)單元，而不是叫做操作種單元或操作屬單元。
這里要注意Taxonomic和Species/genus的關(guān)系，誰(shuí)是誰(shuí)的充分條件，誰(shuí)是誰(shuí)的必要條件。
-----------------------------------------------BOX 3 END----------------------------------------------

好了，得到了OTU序列。那就數(shù)一下唄。
不過(guò)這里要注意，OTU即可代表物種，一條OTU能夠標(biāo)志一個(gè)物種。
甚至為方便理解，采用佛家“色即是空，空即是色”的表達(dá)方式，我們可以更過(guò)分一點(diǎn)：OTU即是物種，物種即是OTU。
數(shù)完了，我們得到一個(gè)數(shù)字，比如50。
沒(méi)錯(cuò)，這個(gè)數(shù)字就是該樣本的alpha多樣性之一，Observed Species。

那么問(wèn)題來(lái)了，你能保證你所觀察到的OTU序列就是環(huán)境樣本中的全部物種么？
顯然這個(gè)是保證不了的，總會(huì)有漏網(wǎng)之魚(yú)沒(méi)有被觀察到。這需要具備一個(gè)抽樣的思想，任何我們觀察到的物種都看成是抽樣，并非總體。也就是說(shuō)，眼見(jiàn)未必為實(shí)。
因此我們需要用數(shù)學(xué)的方法基于樣本來(lái)估計(jì)總體。
于是乎，1984年Chao[1]開(kāi)發(fā)了一個(gè)算法用以估計(jì)真實(shí)總體的物種數(shù)，計(jì)算公式如下：

S_{chao1} =S_{obs} +S_{pred} =S_{obs} +\frac {n_{1}^2} {2n_{2}}

S_{chao1} : 最終估計(jì)的OTU數(shù)目。
S_{obs} : 觀察到的OTU數(shù)目。
n_{1}: 只含有1條序列的OTU數(shù)目，即只被觀察到1次的物種（暫定義為痕量物種）的數(shù)量。
n_{2} : 只含有2條序列的OTU數(shù)目，即只被觀察到2次的物種（暫定義為微量物種）的數(shù)量。
由于n_2有可能為0，而導(dǎo)致公式第二部分沒(méi)有意義，所以有人把這個(gè)公式修正了一下：

S_{chao1} =S_{obs} +S_{pred} =S_{obs} +\frac {n_{1}(n_{1}-1)}{2(n_{2}+1)}

為方便表達(dá)，我們定義n為某一OTU(物種)包含的序列(個(gè)體)數(shù)，即OTU(物種)種的絕對(duì)豐度。
S_{chao1} 的公式包括兩部分，第一部分就是現(xiàn)在我們觀察到的物種數(shù)（S_{obs} ），顯然第二部分就是沒(méi)觀察到的物種數(shù)（S_{pred} ），S_{pred} 就是基于n_{1} 和n_{2} 推算出來(lái)的。
這里，我們可以嘗試計(jì)算一下BOX2中地點(diǎn)A、B和C的S_{chao1} 。
地點(diǎn)A：S_{chao1} =6+3*(3-1)/2*(1+1) = 7.5
地點(diǎn)B：S_{chao1} =6+2*(2-1)/2*(1+1) = 6.5
地點(diǎn)C：S_{chao1} =6+3*(3-1)/2*(0+1) = 9
A、B和C3個(gè)地點(diǎn)的S_{obs}都是6，但S_{pred}分別為1.5，0.5和3。
A和B比較，n_1的增加可使S_{pred}呈現(xiàn)二次方增長(zhǎng)。這就是說(shuō)當(dāng)觀察結(jié)果存在越多的痕量物種(n=1)時(shí)，就表明還可能有更多的物種沒(méi)有被觀察到。
A與C比較，n_2對(duì)S_{pred}貢獻(xiàn)起到一定的反比例抑制作用。可理解為，當(dāng)多種微量物種被觀察到時(shí)，觀察到的痕量物種未必會(huì)是真正的痕量物種，有可能是微量物種，所以微量物種的存在將使得痕量物種對(duì)多樣性的貢獻(xiàn)力度大打折扣。
當(dāng)然對(duì)于n_2在這個(gè)公式中起到的意義，這句只是我的理解，具體有一個(gè)詳細(xì)的推導(dǎo)過(guò)程，可參見(jiàn)Chao在1984年的那篇經(jīng)典文章，歡迎數(shù)學(xué)功底深厚的同學(xué)討論。
再者，可以比較一下S_{pred}的分子和分母，n_{1}(n_{1}-1)要比2(n_{2}+1)變化速度更快，即S_{pred}對(duì)痕量物種更加敏感。
高豐度的物種(n≥3)的數(shù)量對(duì)S_{pred}并無(wú)任何作用。
舉例說(shuō)就是，不論地點(diǎn)A有11頭野牛和200頭野牛，對(duì)A地的Chao1指標(biāo)的大小并無(wú)影響。
極端假設(shè)一下，如果一個(gè)群落樣本中全部都是高豐度物種，即抽樣調(diào)查中物種被抽到2次以上，則表明很可能觀察到的物種數(shù)就是真實(shí)的物種數(shù)。
由此可見(jiàn)，chao1是度量物種類(lèi)別多樣性的指標(biāo)，是針對(duì)總體物種數(shù)量的推測(cè)，與豐度、均勻度無(wú)關(guān)，對(duì)稀有物種很敏感。

根據(jù)Chao1的公式不難看出，對(duì)未觀察到物種的估計(jì)僅僅考慮到豐度為1和2的物種。那么，僅僅考慮豐度為1和2的物種會(huì)不會(huì)有些問(wèn)題？豐度為3的呢？豐度為4的呢？……
1992年，Chao等[2]又開(kāi)發(fā)出一個(gè)新的方法用來(lái)估計(jì)物種的豐富度——ACE指數(shù)。這個(gè)指數(shù)對(duì)微量物種的考慮范圍擴(kuò)大到了10，也就是說(shuō)考慮到了豐度為10以?xún)?nèi)的物種(定義為稀有物種)，公式如下：

S_{ACE}=S_{abund}+\frac {S_{rare}} {C_{ACE}}+\frac {F_1} {C_{ACE}} γ_{ACE}^2

C_{ACE}=\frac{N_{rare}-F_1} {N_{rare}}=1 –\frac{ F_1} {N_{rare}}
N_{rare}=\sum_{i=1}^{10} iF_i
γ_{ACE}^2=max[\frac{S_{rare}\sum_{i=1}^{10} i(i-1)F_i} {C_{ACE}(N_{rare})(N_{rare}-1)} -1,0 ]

S_{rare}為稀有物種的數(shù)量(n≤10)，S_{abund}為高豐度物種的數(shù)量(n>10)，這里觀察到物種的總數(shù)S_{obs}=S_{abund}+S_{rare}。參數(shù)C_{ACE}用于衡量豐度n≥2且n≤10的物種豐度總覆蓋率。N_{rare}為所有稀有物種豐度之和；F_i為豐度為i的物種的數(shù)量。
因此，\frac {S_{rare}} {C_{ACE}}為應(yīng)用豐度n≥2且n≤10的物種估計(jì)的稀有物種數(shù)量。
另一個(gè)參量γ_{ACE}^2用于估計(jì)F_i的變異系數(shù)，max[X,0]的意思就是如果X<0，這個(gè)式子就等于0。
接下來(lái)，咱們?cè)摻忉屢幌?img class="math-inline" src="https://math.jianshu.com/math?formula=%5Cfrac%20%7BF_1%7D%20%7BC_%7BACE%7D%7D%20%20%CE%B3_%7BACE%7D%5E2" alt="\frac {F_1} {C_{ACE}} γ_{ACE}^2" mathimg="1">啦！
其實(shí)就一句話(huà)：為應(yīng)用豐度為1 (n=1)的物種推算出的稀有物種數(shù)量。
三者相加就是ACE的指標(biāo)。
繼續(xù)老套路，我們?cè)賴(lài)L試計(jì)算一下一個(gè)地點(diǎn)A、B和C的S_{ACE}：
地點(diǎn)A：N_{rare}=1*3+2*1+3*0+4*0+…10*0= 5
C_{ACE} = 1 – \frac{3}{5} =0.4
γ_{ACE}^2=max[\frac{4*(1*(1-1)*3+2*(2-1)*1+0)} {0.4*5*(5-1)},0]= 1
S_{ACE}=2+\frac {4} {0.4}+(\frac {3} {0.4})*1= 19.5
地點(diǎn)B：N_{rare}=1*2+2*1+3*0+4*0+…7*0+8*1+9*0+10*1= 22
C_{ACE} = 1 – \frac{2}{22} =0.91
γ_{ACE}^2=max[\frac {5*(1*(1-1)*2+2*(2-1)*1+8*(8-1)*1+10*(10-1)*1)} {0.91*22*(22-1)},0]= 1.76
S_{ACE}=2+\frac{5} {0.91}+(\frac{2} {0.91})*1.76= 11.36
地點(diǎn)C：
N_{rare}=1*3+2*0+3*1+4*0+…+10*1=16
C_{ACE} = 1 – \frac {3} {16}= 0.81
γ_{ACE}^2=max[\frac { 5*(1*(1-1)*3+2*(2-1)*0+3*(3-1)*1+..+10*(10-1)*1 ) } { 0.81*16*(16-1) }, 0]= 0.41
S_{ACE}=2+\frac { 4 } { 0.57 }+(\frac { 2 } { 0.57 } )*1.00= 7.95

這么一看，Chao1和ACE兩個(gè)指標(biāo)算出來(lái)的結(jié)果并不是很一致，兩者都會(huì)低估樣本物種容量較低時(shí)的真實(shí)物種類(lèi)別豐富度。例如，當(dāng)一個(gè)樣本中只有一個(gè)豐度為2的物種且其他的物種豐度都是1的時(shí)候，S_{chao1}的值為\frac {S_{obs}^2+1} {2}。因此，S_{chao1}會(huì)與樣本物種容量大小有很強(qiáng)的相關(guān)性，除非S_{obs}達(dá)到2倍的真實(shí)物種類(lèi)別豐富度的平方根[3]。而不管是微生物宏基因組學(xué)研究中樣本的物種容量還是真實(shí)的自然生態(tài)系統(tǒng)中的可觀察物種遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于舉例中的三個(gè)地點(diǎn)，因此應(yīng)該是足夠的。

物種類(lèi)別豐富度指標(biāo)Chao1和ACE，即可用于估計(jì)野豬和獅子等生存的大型生態(tài)環(huán)境，也可用于估計(jì)腸道和土壤等的微環(huán)境。
以野豬的視角來(lái)看，整大型個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的物種類(lèi)別豐富度，可形象謂之為上帝視角，夠“宏”吧？
以大腸桿菌的視角來(lái)看，腸道的物種類(lèi)別豐富度，亦為上帝視角，夠“宏”吧！
到此為止物種類(lèi)別豐富度指標(biāo)我們已然介紹完畢。
至于囊括豐度和均勻度的Shannon和Simpson指標(biāo)……
呃……現(xiàn)在已然是2019年3月30日1點(diǎn)60，
咦，我好像聽(tīng)到了雞叫，
管他呢，困了，天色已晚，洗洗睡……

備注：此文于2019年3月29日發(fā)于e媛微生態(tài)。

參考文獻(xiàn)
[1] Chao A . Nonparametricestimation of the number of classes in a population[J]. Scandinavian Journal of Statistics, 1984, 11: 265-270.
[2] http://scikit-bio.org/docs/0.4.1/generated/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html
[3] Hughes J B , Hellmann J J , Ricketts T H , et al. Counting the Uncountable: Statistical Approaches to Estimating Microbial Diversity[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(10): 4399-4406.

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