工具介紹
Mash擴展了MinHash降維技術，使其成對的突變距離和P值顯著性檢驗，從而可以有效地聚類和搜索大量序列集合。混搭將大序列和序列集還原為較小的代表性草圖，進而可以快速估計基因組之前全局突變距離。MASH能用于聚類NCBI RefSeq中所有的基因組，基于組裝或者它的reads的實時的基因組聚類，聚類大量的宏基因組數據集。 該工具最終發(fā)表在Genome Biology上。
工具下載與基本使用
Github上很貼心，可以直接下載已經編譯好的版本：
wget https://github.com/marbl/Mash/releases/download/v2.2/mash-Linux64-v2.2.tar
解壓之后就能直接使用了
tar -zxvf mash-Linux64-v2.2.tar
cd mash-Linux64-v2.2/
./mash
我們簡單看看其幫助文檔：
Mash version 2.2
Type 'mash --license' for license and copyright information.
Usage:
mash <command> [options] [arguments ...]
Commands:
bounds Print a table of Mash error bounds.
dist Estimate the distance of query sequences to references.
info Display information about sketch files.
paste Create a single sketch file from multiple sketch files.
screen Determine whether query sequences are within a larger mixture of
sequences.
sketch Create sketches (reduced representations for fast operations).
triangle Estimate a lower-triangular distance matrix.
Mash 提供兩個基本功能用于序列之間的比對 sketch 和 dist。 sketch 功能將序列轉化為哈希結構圖。 dist 功能比對 序列之前的sketches結果并且返回 Jaccard index的估計值,P值, 還有Mash距離, 這些值能用于估計一個簡單進化模型的序列突變率。
具體使用例子
理論說了一大通，現在到大家最關鍵的環(huán)節(jié)，這個工具究竟可以怎么用？
例子一：基因組之間的遺傳距離對比
下載兩個Ecoil的測試數據：
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/genome1.fna
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/genome2.fna
由于基因組比較小，這里直接調用mash dist的功能：
mash dist genome1.fna genome2.fna
查看結果,不出意料兩個基因組遺傳距離非常接近：
###Reference-ID, Query-ID, Mash-distance, P-value, and Matching-hashes
genome1.fna genome2.fna 0.0222766 0 456/1000
當然如果我們是要比對差別很大的，兩個或者多個很大的基因組，直接使用dist功能就會很慢。這里mash的手冊上推薦先使用sketch功能轉化基因序列：
mash sketch genome1.fna
mash sketch genome2.fna
mash dist genome1.fna.msh genome2.fna.msh
除了基因組序列外，該功能還能直接應用到序列的reads中（fastq文件）。通過計算不同fastq文件之間的遺傳距離，并將遺傳距離結果整合可視化，你可以快速的得到你的不同個體測序序列之間的遺傳關系：
關于如何具體建樹我這里就不細說，但是給大家推薦一個非常實用的Github網站，這個網站已經將Mash構樹的過程封裝好為mashtree，使用起來非常方便。Github鏈接：https://github.com/lskatz/mashtree
例子二：構建本地序列的mash數據庫進行遺傳距離分析
除了上面介紹的例子之外，mash還支持使用已知的序列構建本地的數據庫，然后利用該構建的數據庫，來對其它序列進行遺傳距離的分析。
使用剛剛下載好的genome1.fna和genome2.fna進行本地mash數據庫的構建：
mash sketch -o reference genome1.fna genome2.fna
構建好后可以使用info功能對構建好的數據庫進行檢查：
mash info reference.msh
###輸出數據庫的信息，證明數據庫構成功：
Header:
Hash function (seed): MurmurHash3_x64_128 (42)
K-mer size: 21 (64-bit hashes)
Alphabet: ACGT (canonical)
Target min-hashes per sketch: 1000
Sketches: 2
Sketches:
[Hashes] [Length] [ID] [Comment]
1000 4639675 genome1.fna gi|49175990|ref|NC_000913.2| Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome
1000 5498450 genome2.fna gi|47118301|dbj|BA000007.2| Escherichia coli O157:H7 str. Sakai DNA, complete genome
下載新的序列，與構建好的mash數據庫進行遺傳距離比對：
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/genome3.fna
mash dist reference.msh genome3.fna
###結果顯示genome3.fna與數據庫的比對結果，可以發(fā)現genome1和genome3遺傳具體是完全一致的（同一個樣本）：
genome1.fna genome3.fna 0 0 1000/1000
genome2.fna genome3.fna 0.0222766 0 456/1000
例子三：與已構建好的RefSeq sketch數據庫進行遺傳距離比對
除了自己構建mash sketch數據庫外，我們當然可以下載一些已經構建好的數據庫。最常用的要數RefSeq sketch數據庫。
下載好RefSeq數據庫：
wget https://gembox.cbcb.umd.edu/mash/refseq.genomes.k21s1000.msh
由于mash沒有給出測試文件，這里從我自己服務器中大豆的數據中抽取一部分進行測試：
head -n 1600 SRR7817178_1.fq > test_1.fq
head -n 1600 SRR7817178_2.fq > test_2.fq
cat test_1.fq test_2.fq >reads.fastq
這里使用-m 2參數來進一步提高結果的質量，這個參數會忽略掉低質量的單拷貝的k-mer：
mash sketch -m 2 reads.fastq
使用已下載好的RefSeq數據庫，對序列的reads進行遺傳相關系查詢：
mash dist refseq.genomes.k21s1000.msh reads.fastq.msh > distances.tab
查看結果：
GCF_000004515.4_Glycine_max_v2.0_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.36893e-05 1/1000
GCF_000297375.1_ASM29737v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.25234e-05 1/1000
GCF_000400935.1_ASM40093v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.16808e-05 1/1000
GCF_000400955.1_ASM40095v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.16542e-05 1/1000
GCF_000837185.1_ViralProj14097_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 1.63576e-05 1/1000
GCF_001411555.1_wgs.5d_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.36883e-05 1/1000
GCF_001578535.1_ASM157853v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 1.98188e-05 1/1000
GCF_001662445.1_ASM166244v1_genomic.fna.gz reads.fastq 0.295981 2.31897e-05 1/1000
首先可以看到這些reads是和大豆(G.max)有較近的遺傳距離，另外reads里面還含有一些污染，與其它細菌病毒有關系。
這里我們可以發(fā)現，mash是可以將reads的污染檢測出來。事實上，mash提供了screen功能專門用于污染檢測：
mash screen -w -p 4 refseq.genomes.k21s1000.msh|sort -gr |head
檢測結果如下：
0.799067 9/1000 1 6.84538e-42 GCF_001343725.1_ViralMultiSegProj188731_genomic.fna.gz [2 seqs] NC_020234.1 Rosellinia necatrix partitivirus 2 RdRp gene for RNA-dependent RNA polymerase, co mplete cds [...]
0.798763 6/672 1 2.34994e-28 GCF_000899295.1_ViralProj176433_genomic.fna.gz NC_018671.1 Sauropus leaf curl disease associated DNA beta, complete genome
0.783786 6/1000 3 2.57053e-27 GCF_001401365.1_ViralProj299179_genomic.fna.gz NC_028095.1 Torulaspora delbrueckii dsRNA Mbarr-1 killer virus strain EX1180 Kbarr-1 killer toxin gene, comple te cds
0.758374 2/666 1 2.73245e-09 GCF_000922435.1_ViralProj259986_genomic.fna.gz NC_024777.1 Small begomovirus-associated satellite isolate Sa19-S1, complete sequence
0.758338 3/1000 1 2.27756e-13 GCF_000911175.1_ViralMultiSegProj225924_genomic.fna.gz [2 seqs] NC_022616.1 Red clover cryptic virus 1 isolate IPP_Nemaro segment 1 RNA-dependent RNA polymer ase gene, complete cds [...]
0.743837 2/1000 27 6.16326e-09 GCF_001590135.1_ViralProj314638_genomic.fna.gz NC_029628.1 Lake Sarah-associated circular virus-21 isolate LSaCV-21-LSMU-2013, complete sequence
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000928835.1_ViralProj268860_genomic.fna.gz NC_025790.1 Black sea bass polyomavirus 1 isolate 2835, complete genome
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000888115.1_ViralProj45931_genomic.fna.gz NC_013801.1 Croton yellow vein mosaic alphasatellite, complete genome
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000848385.1_ViralProj14678_genomic.fna.gz NC_001782.1 Saccharomyces cerevisiae killer virus M1, complete genome
0.743837 2/1000 2 6.16326e-09 GCF_000004515.4_Glycine_max_v2.0_genomic.fna.gz [1191 seqs] NC_016088.2 Glycine max cultivar Williams 82 chromosome 1, Glycine_max_v2.0, whole genome shotgun
可以看到相對上面的結果，screen功能能夠輸出更加清晰的污染檢測結果，包括了identity, shared-hashes, median-multiplicity, p-value, query-ID, query-comment等一系列的信息，更便于污染檢測。
小結
mash的使用到這里就結束了，我盡量介紹了mash最常用的功能，更多的具體用法還需要大家回到其工作手冊進行查詢（原文鏈接）。總的來說，mash最大的優(yōu)點就是速度快，使用方便，準確率高，是一款非常實用的小軟件。
