? ? ?Science | 湯富酬研究組與合作者揭示人類結(jié)直腸癌發(fā)病新機制

????????2018年11月30日，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）湯富酬研究組，與北醫(yī)三院付衛(wèi)研究組、喬杰研究組，在《Science》期刊發(fā)表了題為“Single-cell Multi-omics Sequencing and Analyses of Human Colorectal Cancer”的研究論文。該研究在國際上首次從單細胞分辨率、多組學水平深入解析了人類結(jié)直腸癌在發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中，基因組拷貝數(shù)變異、DNA甲基化異常及基因表達改變的特點及相互關(guān)系。

????????結(jié)直腸癌是發(fā)病率和死亡率很高的一種癌癥?；蚪M不穩(wěn)定性、表觀遺傳學異常及基因表達紊亂等是結(jié)直腸癌典型的分子特征。腫瘤組織具有很強的異質(zhì)性，以往在大量細胞水平的研究只能反映腫瘤組織的系綜平均情況，而無法精準區(qū)分不同的腫瘤亞克隆以及腫瘤微環(huán)境中的其他細胞類型。一般的單細胞單組學測序技術(shù)只能分別研究單細胞基因組、單細胞DNA甲基化組、或者單細胞轉(zhuǎn)錄組，不能做到在一個單細胞中同時平行分析多個組學層面。湯富酬研究組對該課題組已發(fā)表的scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing technique）技術(shù)進行了大幅度的優(yōu)化，極大地提升了對單個細胞轉(zhuǎn)錄組的檢測效率和DNA甲基化位點（CpG位點）的覆蓋度，達到與利用完整單細胞進行高精度轉(zhuǎn)錄組分析、或者利用完整單細胞進行高精度DNA甲基化組分析相近的效果。在HEp-2細胞系中，單個完整細胞的高精度轉(zhuǎn)錄組測序平均可以檢測到9,158個基因的表達，而scTrio-seq2的轉(zhuǎn)錄組部分平均可以檢測到8,106（88%）個基因的表達；DNA甲基化組方面，scTrio-seq2的DNA甲基化組部分和單個完整細胞的高精度DNA甲基化組測序（scBS-seq）均可以檢測到1600多萬個CpG位點。該研究對患有結(jié)直腸癌并伴隨轉(zhuǎn)移的12例患者的原發(fā)位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移位、肝轉(zhuǎn)移位等樣品進行了多點取樣，對1,800多個細胞進行了高精度的單細胞多組學測序（scTrio-seq2），共產(chǎn)生了7.6 Tb高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。scTrio-seq2的DNA甲基化組部分，平均每個細胞的測序量為4.1 Gb，平均覆蓋到全基因組范圍的870多萬個CpG位點；scTrio-seq2的轉(zhuǎn)錄組部分，平均每個細胞測序量為0.9 Gb，平均可覆蓋到3700多個基因。

????????該研究的主要發(fā)現(xiàn)有：

????????（1）基于DNA甲基化組數(shù)據(jù)推斷出的基因組拷貝數(shù)變異精準鑒定了腫瘤細胞的亞克隆。該研究精準鑒定出了結(jié)直腸癌患者單個癌細胞的染色體拷貝數(shù)變異譜，并利用其高精度的染色體內(nèi)斷點信息進行了腫瘤細胞的譜系追蹤。對于其中5例患者，在每個患者腫瘤組織中鑒定出了多個（6-13個）腫瘤細胞亞克隆，發(fā)現(xiàn)原發(fā)位腫瘤的亞克隆結(jié)構(gòu)通常比轉(zhuǎn)移位腫瘤更復(fù)雜。

????????（2）系統(tǒng)解析了腫瘤細胞的DNA甲基化異質(zhì)性。在全基因組水平，檢測到腫瘤細胞的DNA甲基化水平普遍低于癌旁的正常上皮細胞，而且DNA甲基化降低的程度存在很大的異質(zhì)性。與癌旁的正常上皮細胞相比，單個腫瘤細胞全基因組DNA甲基化水平可降低7-36%。腫瘤細胞特異性DNA低甲基化基因組區(qū)域顯著富集在LTR、LINE等基因組重復(fù)序列和異染色質(zhì)區(qū)域，而腫瘤細胞特異性DNA高甲基化的基因組區(qū)域顯著富集在CpG島和常染色質(zhì)區(qū)域。

圖5. 不同結(jié)直腸癌患者及取樣部位的單細胞DNA甲基化水平

????????（3）闡明了DNA甲基化譜和遺傳譜系的相互關(guān)系。利用鑒定出的腫瘤細胞遺傳譜系信息，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的基因組DNA甲基化譜與遺傳譜系高度一致，同一塊腫瘤組織中同一譜系的腫瘤細胞DNA甲基化水平高度相似，而不同譜系的腫瘤細胞DNA甲基化水平可存在很大差異。所以腫瘤組織基因組DNA甲基化的強烈異質(zhì)性主要來自同一個患者腫瘤內(nèi)不同亞克隆之間的DNA甲基化差異，而不是同一個亞克隆內(nèi)部不同細胞間的DNA甲基化差異。

圖6. CRC01患者不同遺傳譜系的癌細胞的單細胞DNA甲基化水平

????????（4）闡釋了DNA甲基化譜和基因表達譜的相互關(guān)系。在單細胞水平，基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化與相應(yīng)基因的表達呈現(xiàn)強烈的負相關(guān)關(guān)系，而基因區(qū)的DNA甲基化與相應(yīng)基因的表達呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。對于測序單細胞數(shù)量較多的4例結(jié)直腸癌患者，其中1例患者腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄組亞群、遺傳亞群（亞克?。?、和DNA甲基化亞群三者之間呈現(xiàn)出一一對應(yīng)關(guān)系；而在另外3例患者中，轉(zhuǎn)錄組亞群、遺傳亞群（亞克?。?、以及DNA甲基化亞群三者之間的關(guān)系較為復(fù)雜，沒有簡單的一一對應(yīng)關(guān)系。

圖7. 腫瘤細胞的遺傳譜系、DNA甲基化、基因表達三者之間單細胞分辨率的對應(yīng)關(guān)系

????????（5）首次在單細胞分辨率追蹤了同一遺傳譜系的腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中DNA甲基化及基因表達的變化情況。對于同一個癌癥患者同一遺傳譜系的腫瘤細胞在從原發(fā)灶到轉(zhuǎn)移灶的轉(zhuǎn)移過程中其全基因組DNA甲基化水平相對穩(wěn)定，而基因組局部區(qū)域的DNA甲基化水平可能發(fā)生較大變化。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的重要基因在轉(zhuǎn)移前后的腫瘤細胞中其RNA表達水平和DNA甲基化水平均沒有發(fā)生顯著改變

????????（6）揭示了結(jié)直腸癌細胞DNA去甲基化的共同特點。在全部進行了單細胞基因組DNA甲基化測序的10個患者中，腫瘤細胞的DNA去甲基化程度與相應(yīng)基因組區(qū)域在癌旁正常上皮細胞中的DNA甲基化水平呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，也就是說，在正常上皮細胞中DNA甲基化越高的基因組區(qū)域，其DNA去甲基化越強烈（DNA甲基化降低的絕對值和降低的相對比例都更大）。DNA去甲基化的程度與基因組重復(fù)序列L1以及癌旁正常組織中H3K9me3標記的異染色質(zhì)區(qū)域的分布密度呈現(xiàn)強烈的正相關(guān)關(guān)系，而與開放的染色質(zhì)區(qū)域以及H3K4me3標記的基因組區(qū)域呈現(xiàn)強烈的負相關(guān)關(guān)系。與正常的早期胚胎發(fā)育過程中的兩次大規(guī)?；蚪MDNA去甲基化相反，相比于L2基因組重復(fù)序列，進化上更為年輕、更為活躍的L1基因組重復(fù)序列經(jīng)歷了更強烈的DNA去甲基化。

????????（7）揭示了結(jié)直腸癌細胞染色體水平的DNA甲基化異常和基因組不穩(wěn)定性的特點。在結(jié)直腸癌細胞中，相比于其他17條染色體，有6條染色體（4號、5號、8號、13號、18號、和X染色體）傾向于發(fā)生更強烈的DNA去甲基化。其中8號、13號、和18號染色體在TCGA數(shù)據(jù)庫（178個非高頻點突變類型的病例樣本）以及該研究的12個病例中均同時具有高頻的拷貝數(shù)變異。在這6條基因組DNA去甲基化更強烈的染色體中，有5條染色體（4號、5號、8號、13號、和X染色體）也同時顯著富集基因點突變（單核苷酸變異）。

????????綜上所述，通過對10例結(jié)直腸癌患者的高精度單細胞多組學測序分析和深度數(shù)據(jù)挖掘，該研究揭示了結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中基因組DNA甲基化變化的關(guān)鍵特征，提示在腫瘤發(fā)生過程中大規(guī)模的DNA去甲基化很可能是早期事件，并在后續(xù)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中保持相對不變，說明相對穩(wěn)定的全基因組DNA低甲基化是結(jié)直腸癌每個腫瘤細胞的基本特征。而同一個患者的同一個亞克隆的腫瘤細胞其轉(zhuǎn)錄組可以仍然有強烈的異質(zhì)性，并且同一個患者的不同亞克隆的腫瘤細胞可以有相同的轉(zhuǎn)錄組亞群，說明腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄組特征中很大一部分是對腫瘤微環(huán)境的動態(tài)響應(yīng)而不完全是由其遺傳譜系決定的。該研究既發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌細胞基因組DNA甲基化層面強烈的患者個體間差異以及個體內(nèi)的腫瘤細胞異質(zhì)性等個性特征，同時也發(fā)現(xiàn)了不同患者個體之間、不同腫瘤部位之間腫瘤細胞DNA甲基化改變的共性規(guī)律，對于基于干預(yù)DNA甲基化的腫瘤治療方案給出了新的啟示。