不想說廢話了，請?jiān)试S我直接上實(shí)驗(yàn)步驟。
昨天我們先是（1）組合好了Oligo；然后（2）把Oligo通過酶切和連接實(shí)驗(yàn)插入到pSpCas9質(zhì)粒中；接著（3）把這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（transformation）到感受態(tài)細(xì)菌中；再來（4）把這細(xì)菌復(fù)活后涂0.1%氨芐西林抗生素LB平皿上，過夜培養(yǎng)12-16 h。
Day 2: inspect the plates for colony growth. Typically, there are no colonies on the negative control plates (ligation of BbsI-digested pSpCas9(BB) alone without annealed sgRNA oligo insert), and there are tens to hundreds of colonies on the pSpCas9(sgRNA) (sgRNA inserted into pSpCas9(BB)) cloning plates.
第二天：檢查克隆生長情況。一般來說，陰性對照不會出現(xiàn)克隆，而陽性結(jié)果會有幾十到幾百個克隆。
From each plate, pick two or three colonies to check for the correct insertion of sgRNA. Use a sterile pipette tip to inoculate a single colony into a 3-ml culture of LB medium with 100 μg ml ? 1 ampicillin. Incubate the culture and shake it at 37 °C overnight. 每塊平板挑2-3個克隆去檢查sgRNA的插入情況。
我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不錯，對照組完全無克隆，實(shí)驗(yàn)組有約150個左右克隆，每個平皿挑了3個去擴(kuò)增。
Day 4的我已經(jīng)提了質(zhì)粒，測了濃度，準(zhǔn)備驗(yàn)證（因?yàn)槊魈煲_組會+文獻(xiàn)匯報(bào)，所以驗(yàn)證部分暫停）。
感謝師兄DZ
