今天就當一個小故事看吧，看了statQuest，感覺講的很棒，于是分享給大家
原版視頻后臺回復(fù)“RNAseq”??
花花今天效率太低寫不完推送，于是我從晚上10點半開始幫她，有點緊張呀
背景 1
假設(shè)有一群正常的神經(jīng)細胞（藍色）和一群變異的神經(jīng)細胞（紅色）
那么，為什么它們會出現(xiàn)差別呢？是什么遺傳機制導(dǎo)致了這個事情呢？
因此，我們需要看一看它們的基因表達差異
背景 2
我們知道，每個細胞都由一堆染色體組成，每個染色體由一堆基因組成，當然并不是所有的基因都是活躍的，只有一部分基因是可以表達，而表達的中間過程就要經(jīng)歷mRNA轉(zhuǎn)錄本，通過高通量測序，我們就能得知：哪些基因是活躍可以表達的，并且產(chǎn)生了多少轉(zhuǎn)錄本（也就是衡量基因表達量的指標）
背景 3
將正常的細胞測一遍，再將變異的細胞測一遍，得到它們的表達量，我們后來就是比較它們的表達量差異
可以看出，基因1在兩組樣本中差異不大或者沒有差異；基因2在正常組中基本不表達，而在變異組中表達量很高，二者差別甚大；基因3有差別但比較小
RNA-seq主要的3步
Step1 構(gòu)建測序文庫
分離RNA=》將RNA打斷成小片段=〉將小RNA片段反轉(zhuǎn)錄成DNA=》加接頭
接頭兩個作用：測序儀識別；允許一臺測序儀同時運行多個樣本，提高性價比
但是需要注意：加接頭的過程是隨機的，并不是所有的接頭都被加上，有些反轉(zhuǎn)錄的DNA片段沒有加上接頭
=》PCR擴增（只有加上接頭的測序片段才能被擴增）=〉質(zhì)量檢查QC（看下文庫的濃度和片段長度）
對文庫進行測序
一塊測序板上（想象下載玻片，其實人家真名是Flowcell）能包含多于400,000,000個片段，垂直于測序板排列。
測序儀有四種顏色的熒光探針A、T、C、G，與測序片段上堿基互補，結(jié)合上就“放煙花”表示慶祝??（就是閃一下自己帶的熒光，比如A帶紅光，G帶藍光，C綠光，T橙光）。當然，這一切都逃不過測序儀自帶的高精度照相機的法眼【測序儀為什么貴？就是在于它的高精度照相機，想想要分辨這么微小的亮光，密密麻麻，密集恐機癥都犯了??】許許多多的測序片段中同一排的堿基測完了，就把原來熒光的那個堿基沖掉了，再放下一個熒光堿基進來結(jié)合、放光
測序就是這樣，結(jié)果就得到了raw data，就是fastq數(shù)據(jù)
Step 2 原始數(shù)據(jù)處理
質(zhì)控=》過濾garbage reads=〉比對到參考基因組=》再數(shù)一下每個基因比對上多少reads
garbage reads：
有些時候接頭并沒有加到測序片段，而是他們直接結(jié)合，也能進行測序，但測得結(jié)果是沒用的
比對到參考基因組
先將大的基因組序列打斷成許多小片段，然后為了方便接下來尋找這些片段，需要對他們進行構(gòu)建索引index（目的就是標注每個小片段的位置）
再將測序的reads和基因組一樣，也是打斷成小片段，然后把它的小片段比對到基因組的小片段上，比對上的會給出位置信息
統(tǒng)計reads數(shù)得到表達矩陣
就想這樣：第一列是基因名（人類基因組有大概2w基因，因此大概有2w行）
其他列是每個測序樣本比對上的數(shù)量（6-成百上千不等），這里的6的考慮的是處理對照各3個重復(fù)，即Bulk-seq；大樣本量的RNA-seq比如Single-cell，每個細胞都是一個樣本，因此成百上千
每一行都是原始的統(tǒng)計值，每個基因在每個樣本中被抓到多少次
標準化表達矩陣
進行標準化的原因是：某些樣本可能本身測序質(zhì)量就差，但并不代表人家沒東西；或者有的樣本測序的時候加的濃度比較高，因此統(tǒng)計時占優(yōu)勢，但并不公平！
因此需要讓大家在同一起跑線
Step 3 可視化
比如PCA分析，看看樣本之間能否區(qū)分開，另外可以排除明顯不對的樣本，比如這里的wt2
然后看差異表達基因（就是正常與變異樣本的差異）
紅色是差異的，黑色是共同的
如果發(fā)現(xiàn)了感興趣的差異基因，怎么辦？
- 這個基因是你研究的，接下來通過實驗驗證
- 對這個基因不熟悉，只是感興趣，就可以做GO、KEGG注釋，看看它在正常還是變異樣本中有富集
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