就像WB和PCR一樣，要是都沒(méi)聽(tīng)過(guò)或者做過(guò)慢病毒，都不好意思說(shuō)自己是做分子生物的。慢病毒將自己的基因整合到宿主中的行為是天性，而科學(xué)家們正是利用這個(gè)天性，使得慢病毒成為優(yōu)質(zhì)、高效且廉價(jià)的基因編輯工具。想想都不由的雞皮疙瘩起來(lái)，從第一次工業(yè)革命到現(xiàn)在才短短幾百年，人類社會(huì)進(jìn)入了技術(shù)爆炸時(shí)代，不斷有新的技術(shù)涌現(xiàn)而來(lái)，盡管如此，新技術(shù)也是舊技術(shù)思維的部分延續(xù)。因此，今天我們來(lái)談?wù)劼《尽?/p>

1. 慢病毒簡(jiǎn)介

慢病毒（lentivirus）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的慢病毒屬，由于慢病毒感染宿主后，在經(jīng)歷較長(zhǎng)的潛伏期后緩慢發(fā)病，因此被稱為慢病毒。先來(lái)看一下慢病毒在逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中的的定位：

Saxena S K, Chitti S V. Molecular Biology and Pathogenesis of Retroviruses[M]//Advances in Molecular Retrovirology. IntechOpen, 2016.

從圖中我們可以獲取以下幾個(gè)信息：
（1）慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，它的“同胞”還有α，β，γ，δ，ε逆轉(zhuǎn)錄病毒（都是按照希臘字母排序的），其中不乏幾個(gè)熟面孔，例如：α中的肉瘤病毒，β中的乳腺腫瘤病毒，γ中的白血病病毒（被用于構(gòu)建載體），δ中的人類T細(xì)胞淋巴病毒，ε中的表皮增生病毒。慢病毒并不是個(gè)例，它的“同胞”們也沒(méi)有逃脫被用于科研研究的命運(yùn)。
（2）可以看到慢病毒在幾個(gè)典型物種中都是免疫缺陷病毒，例如在人類上大名鼎鼎的HIV病毒。

2. HIV病毒

目前在分子克隆領(lǐng)域中我們主要接觸的慢病毒載體系統(tǒng)就是從人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency viruses，HIV）改造而來(lái)的。HIV病毒分為1型和2型，其中1型是造成人類AIDs的主要原因（HIV病毒仍然有非常詳細(xì)的亞分類），下面我們以1型為例介紹慢病毒的生命結(jié)構(gòu)。

image.png

從上圖HIV-1的基因結(jié)構(gòu)和病毒示意圖我們可以了解到：

（1）HIV-1是擁有二倍體RNA基因組（9.7 kb）的包膜病毒，可以看到圖中有兩條RNA；
（2）HIV-1用有9個(gè)功能基因：3個(gè)結(jié)構(gòu)基因（gag, pol, env）， 2個(gè)調(diào)節(jié)基因（tat, rev）和4個(gè)輔助基因（vif, vpu, vpr, nef）。除此之外，還要注意兩側(cè)的LTR序列，tat需要與LTR序列結(jié)合才可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；
（3）HIV-1入侵人體T細(xì)胞過(guò)程：Env與CD4+ T淋巴細(xì)胞表面的CD4受體、CCR5/CXCR4共受體結(jié)合；之后Env構(gòu)象改變并暴露gp41亞基上的融合肽，該融合肽介導(dǎo)膜融合并誘導(dǎo)病毒核心進(jìn)入；病毒核心一旦進(jìn)入細(xì)胞，就會(huì)脫去外殼并釋放出遺傳物質(zhì)ssRNA；在Pol編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶幫助下逆轉(zhuǎn)錄成DNA并整合到宿主基因組中。之后就是借雞生蛋的故事了。

addgene-lentivirus guide

3. 慢病毒載體系統(tǒng)

關(guān)于慢病毒載體系統(tǒng)，目前有4代慢病毒系統(tǒng)。了解慢病毒系統(tǒng)的組成和分類，對(duì)我們選擇慢病毒工具具有指導(dǎo)意義。

Canadian Biosafety Guideline - Lentiviral Vectors

通過(guò)上圖可以看到，慢病毒載體系統(tǒng)一般會(huì)包含有：
（1）Transfer/Vertor plasmid：包含我們想要轉(zhuǎn)入的目的基因序列。

轉(zhuǎn)基因序列的兩側(cè)是長(zhǎng)末端重復(fù)（LTR）序列，在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中整合到宿主基因組的是LTRs之間的序列，包括LTRs?；贖IV-1病毒的慢病毒基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，出于安全考慮，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒都不能自我復(fù)制，并且三代包裝質(zhì)粒在3'LTR中包含一個(gè)額外的缺失，使病毒在整合后自我滅活（self-inactivating，SIN）。

（2）Packaging plasmid(s)：形成核心蛋白
（3）Envelope plasmid：形成包膜糖蛋白

3.1 一代慢病毒系統(tǒng)

這里的慢病毒分類主要依據(jù)上圖來(lái)劃分，比較方便介紹。實(shí)際上文章中還指出第一代慢病毒系統(tǒng)是兩質(zhì)粒系統(tǒng)：由于產(chǎn)生病毒的滴度低，且只能感染CD4 +細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中包裝的蛋白DNA和載體DNA有重組的可能，進(jìn)而產(chǎn)生有產(chǎn)生有復(fù)制能力病毒且可能有HIV活性的病毒，風(fēng)險(xiǎn)程度大。
這里我們說(shuō)的病毒第一代慢病毒載體系統(tǒng)是由HIV衍生的三質(zhì)粒系統(tǒng)：
（1）包含Ψ啟動(dòng)子（LTRΨ）的基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒
（2）包裝質(zhì)粒
（3）包膜制粒，為了增加慢病毒載體系統(tǒng)的趨向性，包膜質(zhì)粒中的env基因可被異源糖蛋白基因取代。當(dāng)env基因被水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因取代后，慢病毒的宿主范圍得以擴(kuò)大。

3.2 二代慢病毒系統(tǒng)

為了進(jìn)一步提高慢病毒載體系統(tǒng)的安全水平，控制HIV致病能力的輔助基因nef、vif、vpu及vpr被從包裝質(zhì)粒上移除，從而減少重組事件的發(fā)生。

3.3 三代慢病毒系統(tǒng)

第三代系統(tǒng)在幾個(gè)關(guān)鍵方面進(jìn)一步改進(jìn)了第二代系統(tǒng)的安全性：
（1）將5' LTR修飾為帶有外源啟動(dòng)子的嵌合5' LTR，該啟動(dòng)子不再依賴于tat激活，由于不再需要tat，所以tat也被從包裝質(zhì)粒中移除，但tat的移除也會(huì)降低病毒的滴度；
（2）將剩余的HIV包裝基因分離為兩個(gè)包裝質(zhì)粒：一個(gè)帶有g(shù)ag和pol，另一個(gè)帶有rev。雖然更安全，但由于添加了一個(gè)額外的質(zhì)粒導(dǎo)致病毒滴度更低且使用更麻煩。
（3）一些第三代系統(tǒng)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的3' LTR存在缺失，在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中被轉(zhuǎn)錄到5' LTR，從而影響啟動(dòng)子活性，最后達(dá)到自我滅活的效果。這種修飾解決了生物安全問(wèn)題：轉(zhuǎn)移和輔助質(zhì)粒之間的重組，由LTRs引起的腫瘤形成。

需要注意：第三代轉(zhuǎn)移質(zhì)粒可使用第二代包裝系統(tǒng)，但第二代轉(zhuǎn)移質(zhì)粒不能用于第三代包裝系統(tǒng)。

3.4 四代慢病毒系統(tǒng)：舉例介紹

經(jīng)過(guò)上面的介紹我們了解到，慢病毒工具從創(chuàng)始之處到現(xiàn)在，盡管針對(duì)其生物安全性的考量，已經(jīng)做了大量的改造，但其生物安全性仍然是一個(gè)非常重要的問(wèn)題，針對(duì)生物安全性的改造仍然是慢病毒系統(tǒng)進(jìn)化的方向。目前已有商用的四代慢病毒載體系統(tǒng)，例如TAKARA的Lenti-X fourth-generation packaging systems：

image.png

可以看到：
（1）該四代慢病毒包裝系統(tǒng)是5質(zhì)粒系統(tǒng)；
（2）用于增強(qiáng)病毒轉(zhuǎn)錄和感染力的Vpr被引入回來(lái)，使得高滴度高感染力的病毒可以產(chǎn)生；
（3）tet-off系統(tǒng)的引入和Tat基因的回引，增加病毒產(chǎn)量；
（4）將三代系統(tǒng)中的gap-pro-pol質(zhì)粒進(jìn)一步分開(kāi)為兩個(gè)質(zhì)粒，這樣具有復(fù)制能力的病毒需要三次重組才能生成，減少了RCR（具有自我復(fù)制能力的慢病毒）時(shí)間的發(fā)生，更為安全。

綜上所述，可見(jiàn)增加慢病毒安全性的目的是：降低具有自我復(fù)制能力的慢病毒。主要手段在于：去除輔助蛋白基因，滅活LTR啟動(dòng)子，拆開(kāi)核心蛋白使得有效重組頻率降低等等。

4. 慢病毒包裝

簡(jiǎn)單說(shuō)一下慢病毒包裝的流程：

image.png

高滴度的慢病毒包裝依賴于高效率的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和適合的生產(chǎn)宿主。因此為了包裝出滴度更高的慢病毒：
（1）挑選合適的工具細(xì)胞：293T或者293FT，具體可參照之前的293細(xì)胞家族介紹文章，此外工具細(xì)胞的健康狀況要足夠好。HEK293：我還是那個(gè)搬磚少年，沒(méi)有一絲絲改變。
目前我們實(shí)驗(yàn)室的是293FT細(xì)胞，該細(xì)胞在低密度是生長(zhǎng)速度緩慢，當(dāng)達(dá)到百分之40融合度之后可以一夜長(zhǎng)滿，雖然兩三天不換液看起來(lái)沒(méi)事，但其實(shí)細(xì)胞個(gè)頭在慢慢變小，偽足也變得細(xì)瘦。293FT細(xì)胞特別怕冷又怕沖撞，培養(yǎng)基不夠溫?zé)釙?huì)使它蜷縮，加培養(yǎng)基滴到都會(huì)被滴出一個(gè)洞，因此即使293具有強(qiáng)大的繁殖能力也禁不住饑寒交迫的折磨，請(qǐng)一定要讓它們好吃好喝，吃飽穿暖。此外，293細(xì)胞最好使用更為早期的代數(shù)，除了隨著代數(shù)增加，細(xì)胞可能老化的原因之外，不要忘了293細(xì)胞的p53蛋白已經(jīng)被SV40大T抗原裹挾，傳代次數(shù)的增加會(huì)引入隨機(jī)突變，這些隨機(jī)突變指不定會(huì)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)以及其生產(chǎn)能力造成影響。
（2）使用高效率的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑：我在之前的文章中推薦使用羅氏公司的X-treme HP reagent，主要原因是效率高，使用方便又大碗。但最近我變卦了，對(duì)于CRISPR screening這樣需要大批量包裝病毒的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，一次就能用到半支lipo 3000，再有錢(qián)的實(shí)驗(yàn)室也禁不起這樣玩，此時(shí)PEI的身影映入眼簾。PEI 20, 000的效果足以和X-treme媲美，而PEI 40, 000（PEI 40k）效率更高，且1 g PEI 40k粉末可以配1 L，現(xiàn)在馬上去買(mǎi)它?。ㄕ?qǐng)斟酌后再?zèng)Q定）
（3）合適的細(xì)胞密度。
（4）良好的質(zhì)粒比例：需要根據(jù)使用的包裝系統(tǒng)不同來(lái)調(diào)整，這是一個(gè)對(duì)病毒滴度影響比較大的point。
（5）適合的收樣時(shí)間點(diǎn)：需要注意慢病毒在常溫下尚且不穩(wěn)定，更何況是在37℃的培養(yǎng)箱，在48 h收取或者24、48 h分別收取后合并。
（6）滴度不夠怎么辦？
高速離心或者加入PEG8000后4000 g，4度離心20 min。

關(guān)于慢病毒包裝方面，相信大家一定有很多很多自己的Tips，鑒于目前我的慢病毒包裝經(jīng)驗(yàn)較少，這里就不放protocol，我在寫(xiě)這篇文章的時(shí)候參考了一些綜述、addgene上的poster、政府生物安全指南以及吳思涵的知乎文章。關(guān)于慢病毒包裝的protocol，相信大家可以隨便一個(gè)地方就能找到非常完整的教程。因此這里我僅僅作為一個(gè)知識(shí)的搬運(yùn)工，整理一些資料并表述一些個(gè)人的想法，達(dá)到知己知彼的效果，并希望也能小小的幫助到別人。