今天和大家分享的是2020年5月發(fā)表在Nucleic acids research（IF：11.147）上的一篇文章，“Cancer-specific mutation of GATA3 disrupts the transcriptional regulatory network governed by Estrogen Receptor alpha, FOXA1 and GATA3”，作者對癌癥相關(guān)GATA3突變進行分類，發(fā)現(xiàn)第二鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnFn2）突變與患者不良預(yù)后相關(guān)。其中R330fs突變（第330位精氨酸雜合移碼突變）改變GATA3的染色質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致侵襲性更強的腫瘤表型。本篇文章中，作者研究了R330fs GATA3突變對ER-α和FOXA1定位和活動的影響。

Cancer-specific mutation of GATA3 disrupts the transcriptional regulatory network governed by Estrogen Receptor alpha, FOXA1 and GATA3GATA3腫瘤特異性突變擾亂雌激素受體α，F(xiàn)OXA1和GATA3調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

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一、文章背景

類固醇激素17β-雌二醇可以激活雌激素受體（ER），而ER-α和轉(zhuǎn)錄因子FOXA1、GATA3在乳腺上皮細胞和乳腺癌中構(gòu)成一個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。其中，GATA3是乳腺癌中最常突變的基因之一，并可以特異性改變FOXA1和ER-α的染色質(zhì)定位。但乳腺癌中GATA3突變?nèi)绾斡绊慐R-α在基因組的定位以及下游ER-α和FOXA1的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)仍未闡明。

二、分析流程

三、結(jié)果解讀

1.ER-α，F(xiàn)OXA1和GATA3共定位與活性染色質(zhì)有關(guān)

在無TF突變的乳腺癌細胞系T47D中研究ER-α，F(xiàn)OXA1，GATA3基因組定位：雌激素條件下對ER-α和FOXA1進行ChIP-seq分析，用HOMER注釋峰，并進行overlap分析。（圖1AB）

將ER-α富集峰分為4組（FDR<0.001）：EFG（ER-α+,FOXA1+,GATA3+）、EF（ER-α+,FOXA1+,GATA3?）、EG（ER-α+,FOXA1?,GATA3+）、ER alone（ER-α+,FOXA1?,GATA3?）。

約50%ER-α峰屬于EFG組，約25%ER-α峰屬于EF組和EG組，表明配體存在的情況下，T47D細胞中大部分ER-α與先鋒因子中的一個或兩個結(jié)合。（圖1C）

用染色質(zhì)開放性，增強子組蛋白標記（H3K4me1和H3K27ac）和抑制性染色質(zhì)標記（H3K27me3）水平分析共定位的意義：EFG和EF組中ATAC-seq，H3K4me1和H3K27ac信號強，而EG和ER-α峰中這些活性染色質(zhì)標記信號較弱。所有組中都可以檢測到ATAC-seq信號，表明ER-α定位于開放染色質(zhì)區(qū)域。（圖1C）

FOXA1和GATA3僅有26%和24%屬于EFG組中，表明ER比FOXA1和GATA3更依賴于轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。EFG組中ATAC和活躍增強子信號最強，可能提示這些細胞在雌激素條件下增殖。（圖1D）

對GATA3峰EFG組臨近基因進行GO分析：這些基因在細胞連接，乳腺發(fā)育和生殖系統(tǒng)發(fā)育中顯著富集，表明ER-α-FOXA1-GATA3協(xié)同結(jié)合的富集對腔細胞是必不可少的。（圖1E）

圖1.ER-α-FOXA1-GATA3共定位位點的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

2.GATA3突變誘導(dǎo)ER-α重分布

突變細胞系CR3（T47DR330fs/wild-type）表達的第二鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnFn2）對GATA3共識序列（WGATAR）的識別非常重要。且大多數(shù)R330fs突變是雜合突變。

對GATA3突變細胞進行ChIP-seq分析并用HOMER注釋，并用EdgeR注釋ER-α染色質(zhì)差異富集（FDR<0.05 |fold change|>1.5）：CR3細胞中ER-α峰數(shù)量減少了約1/3。與wt相比，突變細胞中約62%ER-α峰信號未改變，約20%ER-α峰信號增強，19%ER-α峰信號減弱。（圖2BC）

ER-α差異結(jié)合對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響：ER-α富集不變的位點K4me1、K27ac和ATAC信號變化很?。籈R-α富集增多的位點ATAC和K27Ac信號也增強，K4me1信號變化很小，提示增強子活動增強；ER-α富集減少的位點K4mel和K27ac信號降低，ATAC信號輕微降低，提示部分位點失活。（圖2DEF）

圖2.R330fs突變誘導(dǎo)ER-α整體重分布

3.GATA3突變改變FOXA1染色質(zhì)定位

FOXA1 ChIP-seq分析和峰差異分析：T47D細胞和CR3細胞的FOXA1峰數(shù)目相近。CR3細胞中約80%FOXA1峰信號未改變，約9%FOXA1峰信號增強，約11%FOXA1峰信號減弱，表明FOXA1重定位頻率比ER-α低。（圖2AB）

FOXA1結(jié)合位點染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化：不被GATA3突變影響的FOXA1結(jié)合位點增強子組蛋白標記和ATAC信號也無變化。FOXA1富集顯著變化的位點，ATAC信號與FOXA1結(jié)合改變呈正相關(guān)，與其作為先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子的作用一致。（圖3C）增強子組蛋白標記也與FOXA1結(jié)合改變呈正相關(guān)。（圖3DE）

圖3.R330fs突變改變FOXA1分布及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

不同GATA3結(jié)合峰中ER-α和FOXA1的結(jié)合變化：GATA3峰的改變與ER-α或FOXA1結(jié)合的改變呈正相關(guān)。（圖4）

圖4.GATA3峰中ER-α和FOXA1的重定位

4.ER-α和FOXA1重分布改變轉(zhuǎn)錄活動

GSEA分析GATA3移碼突變對基因表達的影響：CR3細胞中，ER-α增強峰位點附近的基因常上調(diào)，ER-α減弱峰位點附近的基因常下調(diào)。同樣，F(xiàn)OXA1結(jié)合的改變與基因表達改變呈正相關(guān)。（圖5AB）

對ER-α或FOXA1相關(guān)基因的GO分析：ER-α或FOXA1降低峰的位點在腺體發(fā)育，上皮細胞發(fā)育和激素信號傳導(dǎo)等通路富集，ER-α結(jié)合增加與細胞粘附通路有關(guān)，F(xiàn)OXA1增加位點在生殖系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)通路中富集。（圖5C）

IPA分析上述差異表達基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子：ER-α和FOXA1峰減少與配體依賴核受體如PPARG調(diào)控的級連信號網(wǎng)絡(luò)下調(diào)有關(guān)。ER-α結(jié)合增加與AHR、CCL5等通路的激活有關(guān)。（圖5DE）

Oncomine分析研究乳腺癌中ER-α和FOXA1差異結(jié)合的臨床意義：GATA3 R330fs突變中的ER-α和FOXA1基因組分布改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的重編碼以及更具侵襲性的表型。

圖5.ER-α和FOXA1重定位與差異基因表達有關(guān)

5.GATA3突變擾亂ER-α-FOXA1-GATA3網(wǎng)絡(luò)

CR3突變細胞中，ER-α，F(xiàn)OXA1和GATA3峰重疊頻率降低。與wt T47D不同，約40%ER-α峰與與FOXA1和GATA3均無共定位。（圖6A）

GATA3突變細胞中，EFG峰GATA3結(jié)合顯著減少，GATA3 alone峰GATA3結(jié)合增加。（圖6C）EFG峰中，ER-α和FOXA1的結(jié)合、染色質(zhì)開放性以及增強子標志均減少。（圖6DE）這些結(jié)果說明，GATA3突變首先影響3個因子共結(jié)合的位點。

GATA3突變對3個因子的共結(jié)合位點的影響：EFG峰中ER-α和FOXA1減少最多。（圖6FG）

圖6.GATA3突變擾亂ER-α-FOXA1-GATA3網(wǎng)絡(luò)

ER-α減少峰中，CR3細胞GATA3 ChIP信號顯著減少；ER-α增加峰中，CR3細胞GATA3中等增加。同樣，F(xiàn)OXA1減少峰中GATA3 ChIP信號也顯著減少。（圖7AB）這些結(jié)果表明，ER-α、FOXA1和GATA3在染色質(zhì)上存在共結(jié)合。

分析差異結(jié)合位點的motif頻率：雖然Metaplot分析中GATA3 ChIP-seq信號在ER-α和FOXA1增強峰中增強，但ER-α和FOXA1增強峰中，GATA3共同基序（WGATAR）比ER-α和FOXA1減少峰少。（圖7CD）

CR3細胞中，與FOXA1結(jié)合減少峰相比，F(xiàn)OXA1結(jié)合增加相關(guān)峰中ER-α motif少，F(xiàn)OXA motif多；與ER-α結(jié)合減少峰相比，ER-α結(jié)合增加峰中FOXA motif少，ER-α motif多。（圖7E~H） motif分析結(jié)果與前面結(jié)果一致：在ER-α, FOXA1和GATA3三個motif存在的位點，ER-α和FOXA1結(jié)合減少峰富集；而在其他轉(zhuǎn)錄因子motif存在的位點，ER-α和FOXA1結(jié)合增加峰富集。

EFG-peak相關(guān)基因在人乳腺癌中的表達：攜帶ZnFn2突變的腫瘤中，EFG相關(guān)基因表達發(fā)生改變，不攜帶或攜帶其他突變類型的腫瘤中沒有這種改變，表明GATA3 ZnFn2突變影響體內(nèi)ER-α-FOXA1-GATA3調(diào)控基因。（圖7I）

這些數(shù)據(jù)共同表明，GATA3 ZnFn2突變擾亂ER-α-FOXA1-GATA3基因調(diào)節(jié)軸。

圖7.motif分析：GATA3突變細胞中EF-α-FOXA1-GATA3復(fù)合體減少

小結(jié)

????????本篇文章中，作者研究一種GATA3突變（R330fs）對ER-α-FOXA1-GATA3調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的影響?；蚪M分析發(fā)現(xiàn)R330fs突變體可以擾亂ER-α和FOXA1的定位，且這三個因子的共結(jié)合位點的富集對乳腺發(fā)育和上皮細胞生物學非常重要。且這組基因在培養(yǎng)的GATA3突變細胞和有相似突變的體內(nèi)腫瘤中差異表達。ER-α和FOXA1在GATA3突變細胞中分布的改變與染色體結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，從而導(dǎo)致基因表達的改變。上述結(jié)果提示，GATA鋅指2突變體在ER-α陽性乳腺癌中起到重要作用。