本文選自nature ，https://doi.org/10.1038/s41586-019-1707-0，喜歡的可以自行下載閱讀。
摘要：鐵死亡是一種鐵依賴的細(xì)胞死亡形式，以磷脂的氧化損傷為特征。到目前為止，人們認(rèn)為鐵死亡只受磷脂氫過氧化物還原酶谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)和自由基捕獲抗氧化劑的控制。然而，闡明特定細(xì)胞類型對鐵死亡敏感的因素對于理解鐵死亡的病理生理作用和如何利用它是至關(guān)重要的。雖然代謝限制和磷脂組成有助于鐵死亡的敏感性，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)解釋細(xì)胞抵抗鐵死亡的自主機制。在這里，我們使用了一種表達克隆的方法來鑒定人類癌細(xì)胞中能夠補充Gpx4缺失的基因。我們發(fā)現(xiàn)視黃素蛋白凋亡誘導(dǎo)因子線粒體相關(guān)2(AIFM2)是一個以前未被認(rèn)識抗鐵死亡的基因。AIFM2被我們重新命名為鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)，最初被描述為促凋亡基因，它對Gpx4缺失引起的鐵死亡具有保護作用。我們進一步證明，FSP1對鐵死亡的抑制是由泛醌(也稱為輔酶Q10，CoQ10)介導(dǎo)的：還原形式的泛醌捕獲脂質(zhì)過氧化自由基，而FSP1使用NAD(P)H催化CoQ10的再生。FSP1的藥理學(xué)靶向與Gpx4抑制劑強烈協(xié)同，在許多癌癥實體中觸發(fā)鐵死亡?？傊現(xiàn)SP1-CoQ10-NAD(P)H途徑是一個獨立的平行系統(tǒng)，與Gpx4和谷胱甘肽協(xié)同抑制磷脂過氧化和鐵死亡。
鐵死亡是由硒酶GPX4控制的。隨著人們認(rèn)識到靶向鐵死亡可能有助于根除患者中的耐藥腫瘤，人們對理解細(xì)胞對鐵死亡的敏感性的機制越來越感興趣。盡管?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)被鑒定為鐵死亡基因，其表達決定了鐵死亡的敏感性，但抑制Gpx4不能在某些癌細(xì)胞中引發(fā)鐵死亡，而不管ACSL4的表達如何，這表明存在替代的耐藥機制。
Genetic suppressor screen uncovers FSP1
為了揭示這些因素，我們從MCF7鐵死亡抗性細(xì)胞系(擴展數(shù)據(jù)圖1A)中產(chǎn)生了一個cDNA表達文庫，并篩選了基因彌補Gpx4丟失(圖1A)。
對14個單細(xì)胞克隆的測序確定了7個，表達Gpx4或AIFM2的克隆(擴展數(shù)據(jù)圖1B)。AIFM2是一種黃素蛋白，最初被描述為p53反應(yīng)基因，并聲稱基于與另一個最初假設(shè)的促凋亡基因的序列相似性而誘導(dǎo)凋亡基因-AIFM1。
因此，為了避免進一步的混淆，我們建議在未來將AIFM2稱為鐵死亡抑制蛋白1(FSP1)。為了驗證，我們在小鼠Pfa1和人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞中穩(wěn)定表達了FSP1(擴展數(shù)據(jù)圖1C，d)。
FSP1過表達的細(xì)胞受到強大的保護，不受藥物和遺傳誘導(dǎo)的鐵死亡的誘導(dǎo)，并無限增殖(圖1B-e，擴展數(shù)據(jù)圖1E-I和補充視頻1)。據(jù)我們所知，這是第一個彌補GPX419損失的酶系統(tǒng)。
FSP1的抗鐵死亡作用與細(xì)胞谷胱甘肽水平、Gpx4活性、ACSL4表達和可氧化脂肪酸含量無關(guān)(擴展數(shù)據(jù)圖1C，d，j，k，2)，
表明FSP1不干擾典型的鐵死亡機制。此外，F(xiàn)SP1對細(xì)胞死亡的保護作用是鐵死亡誘導(dǎo)劑所特有的；FSP1對細(xì)胞毒性化合物和/或促凋亡條件引起的細(xì)胞死亡沒有保護作用。此外，p53狀態(tài)不影響FSP1的表達(擴展數(shù)據(jù)圖3A-e)。與FSP1相反，AIFM1的過表達未能抑制鐵死亡(擴展數(shù)據(jù)圖3f，g)。
N-myristoylation enables ferroptosis resistance
我們早期的研究表明，FSP1的N端標(biāo)記取消了其抗鐵死亡活性。事實上，FSP1的N端包含一個典型的肉豆蔻酰化基序，這可能促進了它與脂質(zhì)雙層的結(jié)合。在Pfa1和HT1080細(xì)胞中表達野生型FSP1和缺乏預(yù)測的肉豆蔻?；稽c(G2A)的突變體FSP1(圖2A)，以及用烷基官能化肉豆蔻酸模擬物(YnMyr)標(biāo)記FSP1，使之能夠特異性富集野生型FSP1。這種富集在fsp1(G2A)突變體中或用PAN-肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑IMP-108822處理后被取消(圖2B)。FSP1的肉豆蔻?；坪跏瞧淇硅F死亡活性的關(guān)鍵，因為用IMP-1088處理的FSP1(G2A)和野生型FSP1表達的細(xì)胞顯示出喪失對鐵死亡的抵抗性(圖2C，d和擴展數(shù)據(jù)圖3H，I)。
因此，我們使用C末端標(biāo)記的融合蛋白評估了野生型FSP1和FSP1(G2A)的亞細(xì)胞分布。雖然FSP1-GFP定位于一個未指明的核周，但它也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體標(biāo)記部分重疊(圖2E和擴展數(shù)據(jù)圖4A)。（有意思，但是在下一篇文章中就是定位于質(zhì)膜發(fā)揮作用）
相反，F(xiàn)SP1(G2A)-GFP分布于整個細(xì)胞，表明鐵死亡可能是在特定的亞細(xì)胞區(qū)域驅(qū)動的。另一項研究對FSP1的亞細(xì)胞定位進行了更深入的研究，該研究揭示了以細(xì)胞膜為靶點的FSP1在抑制鐵死亡中的顯著作用。
FSP1 prevents lipid peroxidation
由于鐵死亡是由磷脂過氧化(PLPO)驅(qū)動的，我們用BODIPY 581/591C11對Pfa1細(xì)胞進行了染色，發(fā)現(xiàn)FSP1過表達可鈍化(1S，3R)-RSL3(RSL3；圖3A)誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化（文中表述非常的精確，把脂質(zhì)過氧化與鐵死亡明確區(qū)分開來，脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的原因，但是并不是脂質(zhì)過氧化就是鐵死亡，有個程度在這里，具體是多少，現(xiàn)在還沒有人能夠回答，脂質(zhì)過氧化的檢測金標(biāo)準(zhǔn)就是做流式細(xì)胞探針檢測，沒有之一）。此外，在Gpx4敲除FSP1過表達的細(xì)胞中，特異性pLPO產(chǎn)物明顯較低(圖3B和擴展數(shù)據(jù)圖4B)。
由于AIF家族成員已被證明具有NADH：泛醌氧化還原酶活性，我們假設(shè)FSP1通過使用NAD(P)H再生親脂性自由基捕獲抗氧化劑來抑制pLPO。還原形式的輔酶q10(coq10-h2)已被報道在磷脂和脂蛋白中是一種很好的捕獲自由基的抗氧化劑，但被認(rèn)為在線粒體外的重要性有限，作為一種有效的再循環(huán)機制，輔酶q10(coq10-h2)在磷脂和脂蛋白中是一種很好的捕獲自由基的抗氧化劑，但作為一種有效的回收機制，fsp1在線粒體外的重要性是有限的。為了研究FSP1和CoQ10-H2之間的可能聯(lián)系，我們通過刪除4-羥基苯甲酸多戊基轉(zhuǎn)移酶(COQ2)產(chǎn)生CoQ10缺陷的HT1080細(xì)胞，COQ2是催化CoQ10生物合成的第一步的酶(圖3C)。輔酶Q10缺失的細(xì)胞在補充尿苷、輔酶Q10或癸基泛醌時正常增殖(擴展數(shù)據(jù)圖4C)。值得注意的是，雖然FSP1-GFP在親本HT1080細(xì)胞中的過表達抑制了鐵死亡，但在COQ2基因敲除細(xì)胞中卻未能做到這一點(圖3D和擴展數(shù)據(jù)圖4D)。
與先前的數(shù)據(jù)顯示，純化的FSP1減少了可變鏈長的泛醌類似物，異源表達的FSP1(擴展數(shù)據(jù)圖4e)催化了附加香豆素?zé)晒鈭F的泛醌類似物的還原。這使得能夠測定FSP1的動力學(xué)參數(shù)，與相關(guān)的氧化還原酶(例如NQO1(Km=7.9×10?7M和Vmax=6.1×10?9MSs?1)相比，該動力學(xué)參數(shù)顯示出相對較低的米氏常數(shù)(Km=1.2×10?5M)和高得多的最大反應(yīng)速率(Vmax=4.1×10?7MS s?1)。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)脫氫抗壞血酸、氧化谷胱甘肽和叔丁基氫過氧化物不能作為FSP1的底物(圖3F)。
為了進一步驗證我們的假設(shè)，即FSP1通過減少CoQ10抑制pLPO，我們使用親脂性烷氧基發(fā)生器(擴展數(shù)據(jù)圖5A，b)與雞蛋磷脂酰膽堿和STY-BODIPY進行了聯(lián)合自氧化實驗。
我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SP1單獨或與其還原共底物NAD(P)H結(jié)合都不能有效地抑制pLPO(擴展數(shù)據(jù)圖5C)，而CoQ10的加入以劑量依賴的方式大大延遲了雞蛋磷脂酰膽堿的自氧化(擴展數(shù)據(jù)圖5D，e)。
這些結(jié)果表明，CoQ10通過FSP1幫助NAD(P)H中的還原物穿梭到脂質(zhì)雙層中，從而抑制脂質(zhì)過氧化的擴散。在這些測定中，NQO1不能以與FSP1相同的能力提供服務(wù)(擴展數(shù)據(jù)圖5f，g)。由于輔酶Q10很容易自氧化，并且在脂質(zhì)雙層內(nèi)動力學(xué)較差，我們想知道α-生育酚是否也有助于防止FSP1-輔酶Q10觀察到的鐵死亡。因此，在與脂質(zhì)衍生的過氧化物自由基反應(yīng)后，α-生育酚既可以通過還原的輔酶Q10再生，也可以直接由FSP1在體外產(chǎn)生，而不需要輔酶Q10(擴展數(shù)據(jù)圖5H-j)。對富含亞油酸的脂質(zhì)體中磷脂氫過氧化物形成的直接監(jiān)測證實了共自氧化實驗的結(jié)果，表明FSP1催化的pLPO在輔酶Q10和α-生育酚存在下進一步增強(擴展數(shù)據(jù)圖5K)。
Loss of FSP1 sensitizes to ferroptosis
基于FSP1提供的強大保護作用和在沒有Gpx4的情況下維持細(xì)胞的可能性，我們設(shè)想在Gpx4基因敲除或缺失的情況下，F(xiàn)SP1過表達細(xì)胞的反篩選野生型背景可能有助于發(fā)現(xiàn)FSP1抑制劑。我們篩選了大約10,000個類藥物化合物，發(fā)現(xiàn)了iFSP1作為一種有效的FSP1抑制劑的鑒定(圖4A)。IFSP1選擇性地誘導(dǎo)過表達FSP1的Gpx4基因敲除Pfa1和HT1080細(xì)胞中的鐵死亡(擴展數(shù)據(jù)圖6A，b)。初步的構(gòu)效關(guān)系研究尚未確定比iFSP1有實質(zhì)性改善的化合物(擴展數(shù)據(jù)圖6C)。
為了確定FSP1是否可以作為癌癥中的鐵死亡抑制因子，我們產(chǎn)生了一種抗人FSP1的單克隆抗體(擴展數(shù)據(jù)圖6D)，并探索了它與主要的鐵死亡蛋白在一組不同來源的人類癌細(xì)胞系中的表達(擴展數(shù)據(jù)圖7)。
事實上，F(xiàn)SP1在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系中都有表達，并且iFSP1治療使這些細(xì)胞對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡非常敏感(擴展數(shù)據(jù)圖8)。
然后，我們從這些細(xì)胞系的選擇中產(chǎn)生了FSP1基因敲除和FSP1過表達的細(xì)胞(圖4b，c和擴展數(shù)據(jù)圖7)，并比較了藥理抑制(IFSP1)和FSP1基因敲除在細(xì)胞對鐵死亡敏感方面的作用。正如預(yù)期的那樣，F(xiàn)SP1的基因缺失比小分子抑制更有效，而在FSP1敲除背景下的iFSP1治療對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡沒有附加效應(yīng)(擴展數(shù)據(jù)圖6e，f)。
值得注意的是，當(dāng)FSP1過表達時，少數(shù)對RSL3敏感的細(xì)胞不能被iFSP1重新增敏。（總體來說，一個蛋白的作用并不是1和0的作用，但是，那0.？的作用其實討論起來更有意義。）這可能是由于藥物代謝和排泄，這些影響應(yīng)該進一步研究(擴展數(shù)據(jù)圖6f)。詳細(xì)的實驗表明，MDA-MB-436細(xì)胞中的FSP1基因敲除降低了它們對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的抵抗力，而小鼠FSP1的重新表達恢復(fù)了細(xì)胞對鐵死亡的抵抗力(圖4D，e)。
對癌癥依賴圖(DepMap；https://depmap.org/portal/))的分析顯示，在一組559Gpx4癌細(xì)胞系中，FSP1的低表達與Gpx4依賴的增加相關(guān)(擴展數(shù)據(jù)圖9A)。此外，在860個癌細(xì)胞系(https://portals.broadinstitute.org/ctrp)(擴展數(shù)據(jù)圖9B))中，FSP1的表達與對鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3、ML162和ML210的耐藥性直接相關(guān)。順鉑或其他已知的細(xì)胞毒性化合物沒有檢測到協(xié)同細(xì)胞死亡(擴展數(shù)據(jù)圖9C，d)，這表明抑制FSP1選擇性地使細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感。這一發(fā)現(xiàn)特別重要，因為耐藥腫瘤只對完全消除Gpx4活性有反應(yīng)；微量的Gpx4足以維持細(xì)胞的存活。此外，Gpx4的藥理靶向可能只達到部分抗腫瘤作用。事實上，在攜帶人類異種移植的小鼠中，一項研究表明，H460腫瘤的生長只能通過同時缺失Gpx4和FSP1來減少，而Gpx4單基因敲除的腫瘤生長正常。
我們的數(shù)據(jù)證明，NADH-FSP1-CoQ10通路是pLPO和鐵死亡的有效抑制劑(圖4F)。因此，磷脂氧化還原動態(tài)平衡可以從谷胱甘肽-Gpx4軸上解離出來，并可以進一步在藥理學(xué)上利用來有效地使癌細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感。我們的發(fā)現(xiàn)解釋了為什么NAD(P)H和甲羥戊酸途徑中的缺陷通過缺失泛醌會聚在FSP1上，從而預(yù)測對鐵死亡的敏感性。此外，我們的數(shù)據(jù)為線粒體外輔酶Q10的抗氧化劑角色提供了一個令人信服的案例，并建議應(yīng)該與FSP1一起進一步研究它的有益作用。
背靠背的另一篇nature 熱熱乎乎的就要來了。
