背景知識(shí)

1.HLA（human leukocyte antigen）：人類白細(xì)胞抗原，它是一組緊密連鎖的基因群，可以控制細(xì)胞間相互識(shí)別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。HLA的部分基因可以編碼細(xì)胞表面抗原受體，成為自身細(xì)胞的"獨(dú)特的信號(hào)"，可以作為免疫系統(tǒng)區(qū)分自身和異體物質(zhì)的基礎(chǔ)

2.Merkel細(xì)胞癌：皮膚Merkel細(xì)胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC)是一種罕見(jiàn)的皮膚侵襲性惡性腫瘤，由Merkel cell polyomavirus (MCPyV，默克爾多元癌細(xì)胞病毒)病毒引起。常見(jiàn)于淺膚色的老年人，有局部復(fù)發(fā)和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的傾向

3.免疫檢查點(diǎn)： 調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和增殖的主要分子。免疫檢查點(diǎn)抑制劑在多種癌癥中的成功應(yīng)用以及MCC的免疫易感性再次為研發(fā)更有效的MCC治療方案帶來(lái)希望

4.CIs(immune checkpoint inhibitors)/ICB(immune checkpoint blockade): 免疫檢查點(diǎn)抑制劑。
T淋巴細(xì)胞是抗腫瘤免疫應(yīng)答中的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別腫瘤特異性抗原(比如致癌病毒、分化抗原，表觀遺傳調(diào)控分子, 以及致癌過(guò)程中產(chǎn)生的新抗原等)產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)。正常狀態(tài)下, T淋巴細(xì)胞通過(guò)表達(dá)一系列激活性(促進(jìn)T細(xì)胞分化增殖)和抑制性(抑制T細(xì)胞分化增殖)受體來(lái)調(diào)控免疫平衡，既可以調(diào)控生理性免疫應(yīng)答, 又不會(huì)過(guò)度激活免疫系統(tǒng)而造成機(jī)體自我損傷。
但是腫瘤微環(huán)境中，隨著腫瘤抗原對(duì)T細(xì)胞的持續(xù)刺激, T細(xì)胞表面的一系列抑制性受體表達(dá)水平升高，同時(shí)配體在癌細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)水平增高，將抑制T細(xì)胞活化增殖并誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，造成免疫逃逸

5.腫瘤新生抗原負(fù)荷（tumor neoantigen burden， TNB）：癌細(xì)胞不斷擴(kuò)增分裂，會(huì)產(chǎn)生很多新的突變。新的突變有一部分會(huì)形成新生抗原，新生抗原可以激活免疫系統(tǒng)。因此腫瘤新生抗原負(fù)荷越高，對(duì)這個(gè)藥物的反應(yīng)性就有可能越大

研究背景

癌癥免疫治療在臨床上前景巨大，但是目前有許多使用這種技術(shù)的患者后來(lái)出現(xiàn)復(fù)發(fā)的狀況。
本文團(tuán)隊(duì)在研究Merkel細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，20%的患者對(duì)免疫治療有初步反應(yīng)，但后來(lái)存在復(fù)發(fā)的情況，預(yù)后不理想。為了提高預(yù)后，理解后期/獲得性免疫治療耐受性的機(jī)理是有必要的。利用細(xì)胞免疫治療臨床試驗(yàn)，可以表征T細(xì)胞《=》抗原的相互作用，進(jìn)而了解復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞-免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，并且為避免腫瘤復(fù)發(fā)應(yīng)采取何種免疫聯(lián)合療法提供幫助。

翻譯理解

Results
8--Identification of and clinical course of second validation patient.（第二驗(yàn)證患者的鑒定和臨床過(guò)程）
為了驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)，我們?cè)噲D對(duì)另一名患者進(jìn)行類似的分析，最好是使用限制不同I類HLA的mcpyv特異性T細(xì)胞治療。在我們機(jī)構(gòu)之前使用mcpyv特異性T細(xì)胞和ICIs治療的所有患者中，我們發(fā)現(xiàn)了另外一名早期反應(yīng)和晚期/獲得性免疫治療耐藥的患者。
患者9245-3，為簡(jiǎn)單起見(jiàn)被稱為驗(yàn)證患者，接受mcpyv特異性CD8+ T細(xì)胞和檢查點(diǎn)抑制治療，這次使用限制HLA-A2和avelumab(抗pd - l1)的T細(xì)胞作為檢查點(diǎn)抑制(補(bǔ)充圖10;NCT0258482) 14、15。該驗(yàn)證患者對(duì)聯(lián)合免疫治療有18個(gè)月的應(yīng)答，在此期間，通過(guò)影像學(xué)和病理評(píng)估，他實(shí)現(xiàn)了完全消退。然而，在18個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)，他在一個(gè)腫瘤部位復(fù)發(fā)，腫瘤被切除(治療后+ 565天)。耐藥腫瘤表達(dá)MCPyV T抗原，免疫組化檢測(cè)pan-HLA-ABC(補(bǔ)充圖10)。

10--scRNAseq of tumor revealed HLA-A transcriptional downregulation.（腫瘤scRNAseq顯示HLA-A轉(zhuǎn)錄下調(diào)。）
對(duì)于驗(yàn)證患者，腫瘤組織僅從晚耐藥/獲得性耐藥時(shí)間(+ 565天)開(kāi)始以可行的冷凍形式存在。因此，使用10x基因組學(xué)5’平臺(tái)的scRNAseq對(duì)該耐藥腫瘤(n = 5397細(xì)胞)以及匹配的外周血(n = 5870細(xì)胞;天+ 559;圖4f-h，補(bǔ)充圖12)提供額外的比較組織。我們?cè)俅斡^察到靶向HLA (HLA- a;F i g。通過(guò)全外顯子組測(cè)序確定的HLA-A DNA序列沒(méi)有變化(補(bǔ)充表4)。從驗(yàn)證患者身上培養(yǎng)腫瘤的嘗試在短期和長(zhǎng)期培養(yǎng)均不成功，因此無(wú)法檢測(cè)干擾素-γ和5-氮雜胞苷的可逆性。

Methods
12-- Transcriptome alignment, barcode assignment and UMI counting（轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，條形碼分配和UMI計(jì)數(shù)。）

患者2586-4(discovery) 利用Cell Ranger v2.0.0， 9245-3 (validation)利用Cell Ranger v2.1.0，進(jìn)行sample demultiplexing, barcode processing and single-cell gene counting。
首先，利用mkfastq流程將原始的BCL文件轉(zhuǎn)為fastq；然后，利用count流程整合了STAR將每個(gè)fastq與hg38和Merkel cell polyomavirus序列（HM011556.1）比對(duì)，比對(duì)后的reads根據(jù)cell barcode以及UMIs進(jìn)行過(guò)濾，接著利用aggr流程將Tumor與PBMC樣本整合，生成兩個(gè)gene-barcode表達(dá)矩陣(tumor和PBMC的)，同時(shí)進(jìn)行了測(cè)序深度的校正

13--Biostatistical analysis—data normalization and correction（生物統(tǒng)計(jì)分析-數(shù)據(jù)規(guī)范化與校正）

與Zheng等人一樣進(jìn)行UMI歸一化處理。只有在至少一個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到至少一個(gè)UMI計(jì)數(shù)的基因被保留用于分析。對(duì)每個(gè)單元格執(zhí)行庫(kù)大小歸一化。UMI計(jì)數(shù)按每個(gè)細(xì)胞中的UMI總數(shù)進(jìn)行縮放，并乘以細(xì)胞間UMI總數(shù)的中位數(shù)。然后將數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，并使用Seurat手冊(cè)中描述的ScaleData R函數(shù)校正不需要的變化源(檢測(cè)到的UMIs數(shù)量)。校正后的歸一化基因條形碼矩陣作為降維和聚類分析的輸入，歸一化基因細(xì)胞條形碼矩陣用于MAST分析，如下所示。

14--Gene expression analysis: discovery patient tumor（基因表達(dá)分析:發(fā)現(xiàn)患者腫瘤）
經(jīng)序列比對(duì)和篩選，共分析7431個(gè)腫瘤細(xì)胞(T細(xì)胞治療前2243個(gè)，T細(xì)胞治療后5188個(gè))。采用經(jīng)過(guò)校正的歸一化基因條碼矩陣進(jìn)行主成分分析(PCA)和t分布隨機(jī)近鄰嵌入(tSNE)分析。首先，保留Seurat選擇的前873個(gè)變量最多的基因(對(duì)數(shù)均值表達(dá)值大于0.0125，離散度(方差/均值)大于0.5)進(jìn)行PCA分析。然后選擇前10個(gè)主組件(pc)進(jìn)行tSNE可視化。使用30的perplexity值執(zhí)行了1000次tSNE迭代。根據(jù)已建立的MCC腫瘤標(biāo)志物NCAM1、ENO2、CHGA、KRT20和TILs標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞分類和聚類。在此之前共有1984個(gè)癌細(xì)胞，獲得性耐藥時(shí)間點(diǎn)的癌細(xì)胞為5131個(gè)。使用R包MAST50進(jìn)行T細(xì)胞治療前后腫瘤細(xì)胞的差異表達(dá)分析。將歸一化的基因-細(xì)胞條碼作為輸入。該模型將細(xì)胞檢出率(CDR)作為協(xié)變量，以校正可能影響細(xì)胞中檢測(cè)到的基因數(shù)量的生物和技術(shù)干擾因素(例如，細(xì)胞大小和擴(kuò)增偏倚)?；虻腻e(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)為5%，折疊改變?yōu)?gt;1.3。

16--Gene expression analysis: validation patient.（基因表達(dá)分析:驗(yàn)證患者）
首先使用聚合校正歸一化基因條碼矩陣進(jìn)行主成分分析和t分布隨機(jī)近鄰嵌入(tSNE)分析。Seurat篩選的前2450個(gè)最易變基因(對(duì)數(shù)均值表達(dá)值大于0.05，離散度(方差/均值)大于0.5)保留用于主成分分析。前10臺(tái)pc用于tSNE可視化。使用困惑值為50的tSNE進(jìn)行了1000次迭代。如前一節(jié)所述，單元格聚類是使用Seurat (FindClusters R函數(shù))中實(shí)現(xiàn)的基于圖的聚類方法進(jìn)行的。使用鄰域大小為20、分辨率為0.6的前10個(gè)pc，識(shí)別出19個(gè)不同的細(xì)胞集群。根據(jù)特異性標(biāo)記的富集程度對(duì)簇進(jìn)行標(biāo)記。R代碼附在補(bǔ)充數(shù)據(jù)4中，數(shù)據(jù)提交給NCBI GEO，附錄118056

17--Treatment with hypomethylating agents.（低甲基化劑處理）
體外腫瘤在添加20%胎牛血清和pen/strep抗生素的RPMI中機(jī)械分離、過(guò)濾并培養(yǎng)48 h。將未處理的腫瘤與5氮雜胞苷(多倫多研究化學(xué)品，終濃度1 μM)或gammainterferon(終濃度1000 IU/mL)處理的腫瘤進(jìn)行比較。用直接唑醇分離RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用RT2 SYBR主混合物和市售引物對(duì)指示基因(Qiagen)進(jìn)行qPCR。每個(gè)條件重復(fù)3次，qPCR重復(fù)2次。