單細胞交響樂22-實戰(zhàn)五 CEL-seq2 胰腺細胞

劉小澤寫于2020.7.20
為何取名叫“交響樂”？因為單細胞分析就像一個大樂團，需要各個流程的協(xié)同配合
單細胞交響樂1-常用的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)SingleCellExperiment
單細胞交響樂2-scRNAseq從實驗到下游簡介
單細胞交響樂3-細胞質(zhì)控
單細胞交響樂4-歸一化
單細胞交響樂5-挑選高變化基因
單細胞交響樂6-降維
單細胞交響樂7-聚類分群
單細胞交響樂8-marker基因檢測
單細胞交響樂9-細胞類型注釋
單細胞交響樂9-細胞類型注釋
單細胞交響樂10-數(shù)據(jù)集整合后的批次矯正
單細胞交響樂11-多樣本間差異分析
單細胞交響樂12-檢測Doublet
單細胞交響樂13-細胞周期推斷
單細胞交響樂14-細胞軌跡推斷
單細胞交響樂15-scRNA與蛋白豐度信息結(jié)合
單細胞交響樂16-處理大型數(shù)據(jù)
單細胞交響樂17-不同單細胞R包的數(shù)據(jù)格式相互轉(zhuǎn)換
單細胞交響樂18-實戰(zhàn)一 Smart-seq2
單細胞交響樂19-實戰(zhàn)二 STRT-Seq
單細胞交響樂20-實戰(zhàn)三 10X 未過濾的PBMC數(shù)據(jù)
單細胞交響樂21-實戰(zhàn)三 批量處理并整合多個10X PBMC數(shù)據(jù)

1 前言

前面的種種都是作為知識儲備，但是不實戰(zhàn)還是記不住前面的知識
這是第五個實戰(zhàn)練習

第一代CEL-Seq由以色列理工學院研究團隊于2012發(fā)表在Cell Reports

CEL-Seq的全稱是：Cell expression by linear amplification and sequencing，采用線性擴增的測序方法，其主要優(yōu)勢在于錯誤率比較低，但是和PCR一樣都存在序列偏向性。另外還具有以下優(yōu)點：

  • 使用barcode允許多種類型的細胞同時分析；
  • 每個細胞在一個管中進行處理，避免了樣本之間的污染

后來在2016年，CEL-seq2誕生，與早期版本相比具有低成本、高靈敏度，并縮短了實驗操作實驗時間

數(shù)據(jù)準備

這里使用的數(shù)據(jù)是： Grun et al. (2016) 中不同人類供體的胰腺細胞

library(scRNAseq)
sce.grun <- GrunPancreasData()

sce.grun
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 20064 1728 
# metadata(0):
#   assays(1): counts
# rownames(20064): A1BG-AS1__chr19 A1BG__chr19 ...
# ZZEF1__chr17 ZZZ3__chr1
# rowData names(2): symbol chr
# colnames(1728): D2ex_1 D2ex_2 ... D17TGFB_95
# D17TGFB_96
# colData names(2): donor sample
# reducedDimNames(0):
#   altExpNames(1): ERCC

rowData(sce.grun)
# DataFrame with 20064 rows and 2 columns
# symbol         chr
# <character> <character>
#   A1BG-AS1__chr19    A1BG-AS1       chr19
# A1BG__chr19            A1BG       chr19
# A1CF__chr10            A1CF       chr10
# A2M-AS1__chr12      A2M-AS1       chr12
# A2ML1__chr12          A2ML1       chr12
# ...                     ...         ...
# ZYG11A__chr1         ZYG11A        chr1
# ZYG11B__chr1         ZYG11B        chr1
# ZYX__chr7               ZYX        chr7
# ZZEF1__chr17          ZZEF1       chr17
# ZZZ3__chr1             ZZZ3        chr1

ID轉(zhuǎn)換

先將symbol轉(zhuǎn)為Ensembl ID
library(org.Hs.eg.db)
gene.ids <- mapIds(org.Hs.eg.db, keys=rowData(sce.grun)$symbol,
    keytype="SYMBOL", column="ENSEMBL")
接下來有兩種處理方式：

第一種：將Ensembl ID加到原來數(shù)據(jù)中

library(scater)
rowData(sce.grun)$ensembl <- uniquifyFeatureNames(
  rowData(sce.grun)$symbol, gene.ids)
rowData(sce.grun)
# DataFrame with 20064 rows and 3 columns
# symbol         chr         ensembl
# <character> <character>     <character>
#   A1BG-AS1__chr19    A1BG-AS1       chr19 ENSG00000268895
# A1BG__chr19            A1BG       chr19 ENSG00000121410
# A1CF__chr10            A1CF       chr10 ENSG00000148584
# A2M-AS1__chr12      A2M-AS1       chr12 ENSG00000245105
# A2ML1__chr12          A2ML1       chr12 ENSG00000166535
# ...                     ...         ...             ...
# ZYG11A__chr1         ZYG11A        chr1 ENSG00000203995
# ZYG11B__chr1         ZYG11B        chr1 ENSG00000162378
# ZYX__chr7               ZYX        chr7 ENSG00000159840
# ZZEF1__chr17          ZZEF1       chr17 ENSG00000074755
# ZZZ3__chr1             ZZZ3        chr1 ENSG00000036549

第二種：將沒有匹配的NA去掉，并且去掉重復的行（因為可能存在一個symbol對應多個Ensembl ID的情況）【這里就試一下這種方法】

keep <- !is.na(gene.ids) & !duplicated(gene.ids)
> sum(is.na(gene.ids));sum(duplicated(gene.ids))
[1] 2487
[1] 2515

sce.grun <- sce.grun[keep,]
rownames(sce.grun) <- gene.ids[keep]
> dim(sce.grun) # 過濾掉2000多基因
[1] 17548  1728

2 質(zhì)控

前幾次實戰(zhàn)的質(zhì)控都很順利，但并不意味著實際操作中這一步就可以跑跑代碼解決
這一次，就遇到了一個常規(guī)代碼解決不了的問題，需要思考+調(diào)整

依然是備份一下，把unfiltered數(shù)據(jù)主要用在質(zhì)控的探索上

unfiltered <- sce.grun

看到這里的數(shù)據(jù)中沒有線粒體基因

table(rowData(sce.grun)$chr)
# 
# chr1 chr10 chr11 chr12 chr13 chr14 chr15 chr16 chr17 chr18 
# 1766   672  1071   947   328   551   532   740  1050   256 
# chr19  chr2 chr20 chr21 chr22  chr3  chr4  chr5  chr6  chr7 
# 1245  1142   484   188   400  1014   693   791   907   825 
# chr8  chr9  chrX  chrY 
# 604   664   658    20

倒是有幾個donor的批次信息

table(colData(sce.grun)$donor)
# 
# D10 D17  D2  D3  D7 
# 288 480  96 480 384

我們之前進行質(zhì)控的時候，一般采用的先使用perCellQCMetrics 指定線粒體計算，然后用 quickPerCellQC 指定ERCC+線粒體進行過濾的策略?，F(xiàn)在既然沒有線粒體的信息，那么在第一步的perCellQCMetrics就不需要加subset參數(shù)了

stats <- perCellQCMetrics(sce.grun)
# 參數(shù)subsets的含義: used to identify interesting feature subsets such as ERCC spike-in transcripts or mitochondrial genes.
# > colnames(stats)
# [1] "sum"                   "detected"             
# [3] "percent_top_50"        "percent_top_100"      
# [5] "percent_top_200"       "percent_top_500"      
# [7] "altexps_ERCC_sum"      "altexps_ERCC_detected"
# [9] "altexps_ERCC_percent"  "total"
然后進行過濾，并讓函數(shù)注意批次信息
qc <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets="altexps_ERCC_percent",
                     batch=sce.grun$donor)
colSums(as.matrix(qc), na.rm=TRUE)
# low_lib_size            low_n_features high_altexps_ERCC_percent 
# 85                        93                        88 
# discard 
# 129
作圖
colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats)
unfiltered$discard <- qc$discard

gridExtra::grid.arrange(
  plotColData(unfiltered, x="donor", y="sum", colour_by="discard") +
    scale_y_log10() + ggtitle("Total count"),
  plotColData(unfiltered, x="donor", y="detected", colour_by="discard") +
    scale_y_log10() + ggtitle("Detected features"),
  plotColData(unfiltered, x="donor", y="altexps_ERCC_percent",
              colour_by="discard") + ggtitle("ERCC percent"),
  ncol=3
)
【重點】發(fā)現(xiàn)了問題

質(zhì)控并非是一帆風順的，遇到問題應該知道如何探索解決

看到ERCC那個圖，很明顯D10和D3沒有被正確過濾，它們中高ERCC的細胞還是沒有被去掉

質(zhì)控過濾有一個前提條件：大部分的細胞都是高質(zhì)量的，但顯然這里的D10、D3不符合這個要求，因此我們需要再次只根據(jù)D17、D2、D7這三個“好一點的樣本”進行過濾

# 重新計算過濾條件
qc2 <- quickPerCellQC(stats, percent_subsets="altexps_ERCC_percent",
    batch=sce.grun$donor,
    subset=sce.grun$donor %in% c("D17", "D7", "D2"))

colSums(as.matrix(qc2), na.rm=TRUE)
# low_lib_size            low_n_features high_altexps_ERCC_percent                   discard 
# 450                       511                       606                       665

這次再作圖看看

colData(unfiltered) <- cbind(colData(unfiltered), stats)
unfiltered$discard <- qc2$discard

gridExtra::grid.arrange(
  plotColData(unfiltered, x="donor", y="sum", colour_by="discard") +
    scale_y_log10() + ggtitle("Total count"),
  plotColData(unfiltered, x="donor", y="detected", colour_by="discard") +
    scale_y_log10() + ggtitle("Detected features"),
  plotColData(unfiltered, x="donor", y="altexps_ERCC_percent",
              colour_by="discard") + ggtitle("ERCC percent"),
  ncol=3
)

看到這次對D10、D3的過濾力度大了很多，基本滿意

最后把過濾條件應用在原數(shù)據(jù)
sce.grun <- sce.grun[,!qc$discard]

3 歸一化

也是使用預分群+去卷積計算size factor的方法

library(scran)
set.seed(1000)
clusters <- quickCluster(sce.grun)
sce.grun <- computeSumFactors(sce.grun, cluster=clusters)
sce.grun <- logNormCounts(sce.grun)

summary(sizeFactors(sce.grun))
# Min.  1st Qu.   Median     Mean  3rd Qu.     Max. 
# 0.09581  0.50459  0.79505  1.00000  1.22212 12.16491
看看兩種歸一化方法的差異
plot(librarySizeFactors(sce.grun), sizeFactors(sce.grun), pch=16,
     col=as.integer(factor(sce.grun$donor)),
     xlab="Library size factors", ylab="Deconvolution factors", log="xy")
abline(a=0, b=1, col="red")

也是再一次證明了去卷積方法比常規(guī)的方法更加精細，對批次層面也會納入考量

4 找高變異基因

既然有批次的信息，那就加到構(gòu)建模型中去，而且有ERCC，就選用modelGeneVarWithSpikes這個方法

block <- paste0(sce.grun$sample, "_", sce.grun$donor)
dec.grun <- modelGeneVarWithSpikes(sce.grun, spikes="ERCC", block=block)
top.grun <- getTopHVGs(dec.grun, prop=0.1)

5 矯正批次效應

使用FastMNN方法：Correct for batch effects in single-cell expression data using a fast version of the mutual nearest neighbors (MNN) method.

library(batchelor)
set.seed(1001010)
merged.grun <- fastMNN(sce.grun, subset.row=top.grun, batch=sce.grun$donor)
merged.grun
# class: SingleCellExperiment 
# dim: 1467 1063 
# metadata(2): merge.info pca.info
# assays(1): reconstructed
# rownames(1467): ENSG00000172023 ENSG00000172016 ...
# ENSG00000144867 ENSG00000179820
# rowData names(1): rotation
# colnames(1063): D2ex_1 D2ex_2 ... D17TGFB_94
# D17TGFB_95
# colData names(1): batch
# reducedDimNames(2): corrected
# altExpNames(0):

檢查一下結(jié)果，使用lost.var ，值越大表示丟失的真實生物異質(zhì)性越多

metadata(merged.grun)$merge.info$lost.var
# D10         D17          D2         D3         D7
# [1,] 0.030843209 0.030956515 0.000000000 0.00000000 0.00000000
# [2,] 0.007129994 0.011275730 0.036836491 0.00000000 0.00000000
# [3,] 0.003528589 0.005027722 0.006846244 0.05020422 0.00000000
# [4,] 0.012070814 0.014673302 0.013972521 0.01267586 0.05281354
  • It contains a matrix of the variance lost in each batch (column) at each merge step (row).
  • Large proportions of lost variance (>10%) suggest that correction is removing genuine biological heterogeneity.

6 降維 + 聚類

降維
set.seed(100111)
merged.grun <- runTSNE(merged.grun, dimred="corrected")
聚類
snn.gr <- buildSNNGraph(merged.grun, use.dimred="corrected")
colLabels(merged.grun) <- factor(igraph::cluster_walktrap(snn.gr)$membership)

# 聚類的分群與批次之間的對比
table(Cluster=colLabels(merged.grun), Donor=merged.grun$batch)
##        Donor
## Cluster D10 D17  D2  D3  D7
##      1   32  71  33  80  29
##      2    5   7   3   4   4
##      3    3  44   0   0  13
##      4   11 119   0   0  55
##      5   12  73  30   3  78
##      6   14  29   3   2  64
##      7    1   9   0   0   7
##      8    2   5   2   3   4
##      9    5  13   0   0  10
##      10  15  33  11  10  37
##      11   5  18   0   1  33
##      12   4  13   0   0   1
最后作圖看看批次效應矯正如何
gridExtra::grid.arrange(
    plotTSNE(merged.grun, colour_by="label"),
    plotTSNE(merged.grun, colour_by="batch"),
    ncol=2
)

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