在上一篇導(dǎo)讀中提到，目前在做小立碗蘚的單細(xì)胞測序，相關(guān)的maker gene已經(jīng)能發(fā)掘到很多，還缺少轉(zhuǎn)型期相關(guān)的maker gene，看到了2015年發(fā)表在《The Plant Journal》的文章，使用了激光切割法取特定組織進行轉(zhuǎn)錄組分析，區(qū)分了tip-cell（最終發(fā)育綠絲體）和bud-cell（最終發(fā)育為配子體），希望能對我尋找轉(zhuǎn)型期相關(guān)基因有所幫助。
Summary
單倍體苔蘚配子體具有不同的干細(xì)胞類型，包括葉尖細(xì)胞分裂成單平面產(chǎn)生絲狀原絲體，芽（bud）細(xì)胞分裂成三個平面產(chǎn)生軸向配子體芽。這種從絲狀生長到三維生長的轉(zhuǎn)變是在苔蘚生命周期中逐漸發(fā)生的，被認(rèn)為是從輪藻綠藻祖先進化而來的第一批陸生植物。形態(tài)復(fù)雜的植物體計劃的創(chuàng)新促進了垂直景觀的定殖，使復(fù)雜的營養(yǎng)和生殖植物形態(tài)得以發(fā)展。盡管它有著深刻的進化意義，但參與從原絲體組織向三平面分生組織轉(zhuǎn)變的分子程序卻鮮為人知。在這項研究中，利用單細(xì)胞型轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定了4000多個差異表達(dá)的基因，這些差異表達(dá)基因區(qū)分了單面原絲體頂端細(xì)胞和多平面配子體芽細(xì)胞。雖然葉尖細(xì)胞和芽細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄體都顯示增殖細(xì)胞的分子特征，但是芽細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)出更廣泛的基因種類，轉(zhuǎn)錄豐度顯著增加。我們的數(shù)據(jù)表明，在苔蘚植物中，與芽模式和不對稱細(xì)胞分裂有關(guān)的基因的聯(lián)合表達(dá)伴隨著從平面到三維分生組織生長的轉(zhuǎn)變。
introduction
陸地植物（胚胎植物）形態(tài)復(fù)雜的體形圖的發(fā)育需要分生組織細(xì)胞在三維平面分裂。與胚胎植物不同的是，陸生植物輪藻綠藻近親的分枝絲狀生長完全是通過二維的細(xì)胞分裂進行的，其中絲狀分枝是由斜向擴展的藻絲平面的細(xì)胞分裂開始的。最有可能的是，向三維分裂分生組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，能夠產(chǎn)生形態(tài)上復(fù)雜的胚胎植物體形，發(fā)生在胚胎植物的一個未知的水生祖先身上。
在苔蘚發(fā)育的單倍體配子體階段，這一關(guān)鍵的進化創(chuàng)新從絲狀體到直立形態(tài)被復(fù)現(xiàn)。與維管植物不同，無核無維管苔蘚的萌發(fā)孢子進行單平面分裂，形成由葉綠體豐富的細(xì)胞組成的絲狀原絲體，稱為綠線體。當(dāng)原絲體頂端細(xì)胞通過單平面分裂延伸纖維時，雙平面細(xì)胞分裂發(fā)生在離尖端更遠(yuǎn)的地方，從而產(chǎn)生分枝狀的原絲體。當(dāng)暴露于誘導(dǎo)的環(huán)境刺激和/或生長素的存在下，綠絲狀體可能會單面分裂，并轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙N絲狀細(xì)胞類型，稱為芽，其中含有傾斜的細(xì)胞壁和很少的葉綠體，雖然約有5%的芽細(xì)胞轉(zhuǎn)化為三維分裂的干細(xì)胞（SCs），稱為配子體芽。芽細(xì)胞是分生組織，形成復(fù)雜的芽軸，稱為配子體，其中包含稱為葉狀體的光合側(cè)生器官。為了收集足夠的芽材料，用萘乙酸和激動素(kinetin)處理，使莖基分枝點的芽（誘導(dǎo)芽）比未處理的對照植株多12倍。
配子體由一個分生組織細(xì)胞發(fā)育而來，同時具有不確定性和器官發(fā)生的功能。在種子植物中，莖分生組織被分成功能上不同的多細(xì)胞區(qū)。分生組織中央?yún)^(qū)分裂不頻繁，維持著不確定的干細(xì)胞生態(tài)位，而外圍區(qū)分裂迅速，啟動側(cè)器官。植物發(fā)育中的一個基本問題是蘚類單細(xì)胞分生組織芽細(xì)胞如何發(fā)揮SC不確定性和器官發(fā)生的綜合功能，這些功能在維管植物莖分生組織中被賦予不同的多細(xì)胞區(qū)。
已知調(diào)節(jié)苔蘚SC特性的關(guān)鍵遺傳因子包括平行的小RNA途徑、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄因子、激素信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)運基因以及細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)因子。在已知的SC調(diào)節(jié)因子列表中，顯著缺失的是KNOTTED 1-like (class I KNOX)基因，它們在被子植物的莖分生組織中起著不可或缺的作用。盡管轉(zhuǎn)錄組學(xué)證據(jù)表明I類KNOX基因MKN2確實在苔蘚的分生組織芽細(xì)胞中表達(dá)，但小立碗蘚 KNOX基因的靶向敲除沒有產(chǎn)生配子體表型。
激光顯微切割和下一代測序技術(shù)的結(jié)合使單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析成為可能。在這里，我微切單平面原絲體頂端細(xì)胞和芽細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞特異性的小立碗蘚轉(zhuǎn)錄組。的目標(biāo)有兩個：（i）探索被子植物莖分生組織在單細(xì)胞頂端和誘導(dǎo)苔蘚芽細(xì)胞中的遺傳程序的程度，（ii）發(fā)現(xiàn)在苔蘚配子體二維單面和三維平面SCs的分子結(jié)構(gòu)。
轉(zhuǎn)錄組比較顯示，成千上萬的基因轉(zhuǎn)錄本區(qū)分了葉尖細(xì)胞和誘導(dǎo)芽細(xì)胞。雖然這兩種SC類型的轉(zhuǎn)錄本都在多能干細(xì)胞類型中得到了豐富的功能，但是誘導(dǎo)的芽細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組顯示出在被子植物中調(diào)節(jié)芽模式和不對稱細(xì)胞分裂的同源基因的積累顯著增加。從這些數(shù)據(jù)中，提出了一個通過莖分生功能和不對稱細(xì)胞分裂相結(jié)合的復(fù)雜身體計劃進化模型。
RESULTS AND DISCUSSION
成千上萬的基因轉(zhuǎn)錄本區(qū)分芽細(xì)胞和頂端細(xì)胞
配子體的發(fā)育經(jīng)歷了從單面分裂形成不分枝細(xì)絲，到形成分枝細(xì)絲的雙面分裂，最后發(fā)展到形成配子體復(fù)雜體形的三維分裂。由于平面和三維生長模式都來自于單個分生組織細(xì)胞，激光顯微切割和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析這兩種不同的SC類型是直接的。在頂端細(xì)胞和芽細(xì)胞群體之間發(fā)現(xiàn)了6957個顯著差異表達(dá)的基因。其中4472個差異表達(dá)基因表現(xiàn)出雙重差異表達(dá)：1043個在單平面葉尖細(xì)胞中上調(diào)，3429個在三維生長誘導(dǎo)的芽細(xì)胞中上調(diào)。數(shù)據(jù)表明，與頂端細(xì)胞相比，芽細(xì)胞處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。
GO富集分類在芽細(xì)胞中豐富，而在尖端細(xì)胞中不豐富
對尖端細(xì)胞和芽細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄物積累的分析表明，與整個植物轉(zhuǎn)錄組相比，有數(shù)千個上調(diào)轉(zhuǎn)錄物（1382個）和下調(diào)轉(zhuǎn)錄物（2135個）。real-time PCR進一步驗證了上調(diào)誘導(dǎo)芽和葉尖基因的表達(dá)模式。GO富集分析確定在誘導(dǎo)芽和葉尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中顯著富集的預(yù)測基因功能。芽細(xì)胞GO預(yù)測主要參與分子模式和發(fā)育。這些包括轉(zhuǎn)錄因子，蛋白激酶，細(xì)胞命運決定和形態(tài)發(fā)生，以及跨膜外排轉(zhuǎn)運。一些與尖端細(xì)胞生長相關(guān)的GO類也富集在芽細(xì)胞，如頂端生長和花粉管生長。原絲體被認(rèn)為是苔蘚尖端生長的主要細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，誘導(dǎo)的配子體發(fā)育的某些基因也出現(xiàn)在尖端細(xì)胞中。
與芽轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的大量發(fā)育模式相關(guān)的GO類別不同，在尖端細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中富集的GO類別大多數(shù)與光合功能有關(guān)。在尖端細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了大量與光合作用相關(guān)的GO類別，表明固碳是頂端細(xì)胞的主要功能之一。根毛發(fā)育過程中GO的富集也被發(fā)現(xiàn)，這進一步證明了苔蘚原絲體和被子植物根毛之間有共同的生長策略。
令人驚訝的是，在尖端細(xì)胞中顯著富集的GO類沒有涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、激素反應(yīng)或表觀遺傳修飾。先前對原絲體細(xì)胞重編程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示，發(fā)育基因的缺失與此類似。
涉及莖分生組織模式和細(xì)胞不對稱分裂的基因在芽細(xì)胞中上調(diào)
為了確定差異表達(dá)的候選基因，從組織特異性轉(zhuǎn)錄組中提取了具有所述發(fā)育功能的被子植物基因同源物。轉(zhuǎn)錄本選自八個功能類別：細(xì)胞壁生物發(fā)生、細(xì)胞骨架和不對稱細(xì)胞分裂、一般發(fā)育、光合作用、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、激素信號、莖尖分生組織發(fā)育和表觀遺傳修飾。下圖顯示了在尖端細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（75個基因）和芽細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（100）中上調(diào)的特定基因轉(zhuǎn)錄本的比較。然而，數(shù)百個功能未知的差異表達(dá)基因在芽或尖端細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體中特異性上調(diào)。
在誘導(dǎo)芽細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中，表達(dá)上調(diào)的基因可以指導(dǎo)芽分生組織模式的形成和不對稱的細(xì)胞分裂。例如，擬南芥受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的同源物，這些基因調(diào)節(jié)莖的分生組織大小和模式，包括CLAVATA 1和2（CLV1和CLV2）、MERISTEMATIC RECEPTOR-LIKE KINASE（MRLK）、絲裂原活化蛋白激酶激酶YODA（YDA）、ERECTA-LIKE，CRINKLY4（CR4）和calpain編碼的信號基因DEFECTIVE KERNEL1（DEK1）。
在被子植物莖分生組織的中心區(qū)和外圍區(qū)，多種染色質(zhì)重塑復(fù)合物調(diào)控著細(xì)胞命運的轉(zhuǎn)變。在bud細(xì)胞中，包括擬南芥SWI/SNF復(fù)合物同源基因在內(nèi)的多種染色質(zhì)重塑基因也上調(diào)，但在tip細(xì)胞中沒有上調(diào)。先前的研究表明，原絲體和配子體具有不同的染色質(zhì)狀態(tài)；這些上調(diào)的染色質(zhì)重塑因子可能參與了染色質(zhì)狀態(tài)的改變。此外，顯示與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用的細(xì)胞周期同源物在誘導(dǎo)芽細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中特別上調(diào)，例如直接SWI/SNF相互作用因子E2F轉(zhuǎn)錄因子（E2F），以及一些周期蛋白（CDC/CYC）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK）。
bud細(xì)胞富含參與控制細(xì)胞不對稱分裂的特定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，包括CYCB1;1，CDKA1;1和E2F的同源物，對分化組織和復(fù)雜植物結(jié)構(gòu)的發(fā)育至關(guān)重要。一種由不對稱細(xì)胞分裂引起的預(yù)測功能是配子體芽細(xì)胞中不均勻的細(xì)胞分裂形葉狀體前體細(xì)胞。與含有10多種細(xì)胞周期調(diào)控因子的誘導(dǎo)芽細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組相比，尖端細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組只有兩個顯著上調(diào)的細(xì)胞周期基因（STRUBBELIG和CYCLOPHILIN 38） 。
在bud細(xì)胞中特異性上調(diào)的其他bud預(yù)測的25個基因控制植物激素生長素、細(xì)胞分裂素和油菜素甾體的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因。最有趣的是，在bud細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了兩個PIN基因的同源物。此外，在bud細(xì)胞中，一種參與PIN蛋白極性定位的蛋白激酶PINOID的同源物也上調(diào)。最近的一項研究表明，在苔蘚配子體中，質(zhì)膜相關(guān)的PIN蛋白是正常芽發(fā)育所必需的。
在被子植物中，大量的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)參與了對細(xì)胞特異性命運和發(fā)育模式的控制。值得注意的是，在tip細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子基因不包括模式植物同源的基因。相比之下，bud細(xì)胞中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物包括與芽圖案有關(guān)的幾種被子植物轉(zhuǎn)錄物的同源物，如DORNROSCHEN-LIKE（DRN-LIKE）和LEAFY（LFY），表皮PROTODERMAL FACTOR 2（PDF2）和SCREAM2（SCRM），以及I類KNOX基因MOSSKNOTTED-
RELATED HOMEOBOX 2（MKN2）。bud細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MKN2上調(diào)表達(dá)是出乎意料的，因為先前的遺傳分析表明，KNOX基因的功能僅限于孢子體世代。
兩種類型的干細(xì)胞都是由一個不可區(qū)分的單細(xì)胞分支點和一個平面細(xì)胞分裂產(chǎn)生的。在這一階段，bud和tip的干細(xì)胞在形態(tài)上相似，但面臨著截然不同的發(fā)展命運，這可能是由僅僅兩次細(xì)胞分裂后數(shù)千個差異表達(dá)的基因所決定的。在單細(xì)胞階段分離bud和tip細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上是不可行的；然而，這項研究可能有助于識別在tip和bud細(xì)胞命運形態(tài)表現(xiàn)之前的分子標(biāo)記。
CONCLUSION
被子植物模式植物基因同源物和不對稱細(xì)胞分裂調(diào)控因子的協(xié)同上調(diào)啟發(fā)了一個模型，其中這些遺傳途徑的協(xié)同作用有助于在形態(tài)復(fù)雜的配子體中發(fā)現(xiàn)新的發(fā)育創(chuàng)新。從這個觀點來看，這些組合的發(fā)育功能所賦予的特性可以使bud細(xì)胞出現(xiàn)新的干細(xì)胞功能，以及由覆蓋側(cè)器官啟動程序的不對稱分裂程序所賦予的器官發(fā)生。分生組織母細(xì)胞的不對稱分裂產(chǎn)生了包括氣孔復(fù)合體的多種細(xì)胞類型；然而，分生組織母細(xì)胞的這種多能性是短暫的。氣孔的最早古植物學(xué)證據(jù)與苔蘚植物的出現(xiàn)相吻合。推測苔蘚配子體分生組織功能發(fā)育途徑的出現(xiàn)，可能在氣孔演化過程中起到了類似的作用。
轉(zhuǎn)載請注明：周小釗的博客>>>文獻導(dǎo)讀：小立碗蘚三維發(fā)育的細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組分析
