REM sleep–active MCH neurons are involved in forgetting hippocampus-dependent memories

Literature_Reading/sleep

Literature_Reading/memory

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臨近考試，需要復(fù)習(xí)，可能要鴿幾周了
這篇文獻是師姐讓我看的，關(guān)于 REM 睡眠的功能
在這里主要講一些文章的思路
其中用到的很多實驗技術(shù)和方法我還不甚了解 (需要整理)
最后談?wù)勎覀冇懻摰囊恍┫敕?/p>

這篇文獻在微信工作號也有很好地解讀，大家可以去看看：
睡眠時遺忘細(xì)胞會清理記憶

下面是我個人的解讀

However, little is known about the neural mechanisms involved in forgetting during sleep. In addition, whether forgetting occurs during non–rapid eye movement (NREM) sleep or REM sleep is unclear.

一般我們認(rèn)為，記憶在白天是由于各種活動而形成，而記憶的鞏固和遺忘發(fā)生在睡眠時期。(記憶這一塊我還沒深入去看，只能說個大概的方向)。

關(guān)于在睡眠時候的遺忘機制很少有研究報道，甚至遺忘是發(fā)生在睡眠的 NREM 期還是 REM 期也說不清。

The hypothalamus is a center for instinctive and homeostasis-related behaviors. Melanin-concentrating hormone (MCH) neurons are exclusively located in the lateral hypothalamic area (LHA) but project broadly throughout the brain (10). MCH neurons also have a prominent role in sleep– wakefulness regulation. Activation of MCH neurons increases time in REM sleep, whereas inhibition reduces transitions into REM sleep.

下丘腦是和激素穩(wěn)態(tài)以及本能行為調(diào)控有關(guān)。而 MCH 神經(jīng)元(黑色素濃縮激素神經(jīng)元)位于下丘腦的外側(cè)區(qū)(LHA)，與睡眠-覺醒周期的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。激活 MCH 神經(jīng)元會增加 REM 睡眠，抑制則會減少。

文章關(guān)注點的重點是：睡眠 和 遺忘。睡眠關(guān)注的是和 REM 密切相關(guān)的 MCH 神經(jīng)元，那么和遺忘相關(guān)的自然就相當(dāng)是海馬區(qū)(hippocampus)

所以有了假設(shè)后，作者就開始做實驗驗證兩者都關(guān)系：

01. direct innervation to the hippocampus

為了驗證和海馬相關(guān)的直接神經(jīng)元，首先他們在海馬的雙側(cè) CA1區(qū)注射了retrobeads (retrogradely transported beads 微珠？不是病毒？我也不清楚是什么需要查)

發(fā)現(xiàn)確實下丘腦(hypothalamus)確實有很多神經(jīng)元投射到海馬CA1區(qū) (Figure 1A， 雖然 DBMS 是最多的，但是文章關(guān)注點是hypothalamus，只要有足量的數(shù)據(jù)支持 hippocampus 和 hypothalamus有直接聯(lián)系，就能說明問題)

隨后由做了免疫組化試驗，證實下丘腦 MCH神經(jīng)元有大量的投射到海馬區(qū)(hypothalamic MCH neurons densely projected to the hippocampus.) (Figure 1B)

Figure 1 A/B 下丘腦MCH神經(jīng)元有直接到海馬CA1區(qū)的神經(jīng)投射.png

02. to confirm where is the MCH nerve terminals

上面已經(jīng)驗證了 MCH 神經(jīng)元 與 海馬有直接投射
接下來是實錘 MCH 神經(jīng)元的神經(jīng)末梢就在海馬里大量分布

他們繁殖出了MCH-tTA; TetO Yellow Cameleon-Nano50 (YC) mice 和 Orexin-tTA; TetO Yellow Cameleon-Nano50 (YC) mice 兩種轉(zhuǎn)基因鼠。在MCH-tTA; TetO YC 小鼠中，MCH 神經(jīng)元會表達可顯色的 YC。

從 Figure 1C 中可以看出，MCH 神經(jīng)末梢在海馬的背側(cè)大量存在，而Orexin神經(jīng)末梢在海馬區(qū)相當(dāng)稀少。

MCH/Orexin 表達和 YC 表達重疊度，說明可以用 YC代表 MCH/Orexin 神經(jīng)元的位置.png

Figure 1C MCH 神經(jīng)元投射到海馬 CA1區(qū)的位置.png

實驗的順序？

03.To evaluate MCH neuron effects on memory,

ok 既然知道兩種的關(guān)系，那下一步就是看看去掉 MCH 神經(jīng)元對小鼠行為有什么影響。
(文章關(guān)注的重點是 REM 睡眠對記憶調(diào)控，記憶和海馬的研究已經(jīng)有一定理論基礎(chǔ))

所以

1. 要有 turn on 和 turn off MCH 方法
2. 要有一個行為范式來評判 記憶是否遺忘

文中先用的化學(xué)遺傳的方法(chemogenetics)調(diào)控MCH 神經(jīng)元的開關(guān)
選擇了新物體辯識實驗 [a novel object recognition (NOR)]，條件情景恐懼[a contextual fear conditioning (CFC) test], 還有后續(xù)的條件恐懼[cued-fear memory]，水迷宮[the Morris water maze] 等行為范式作為評價小鼠遺傳程度的測試。

(具體的實驗細(xì)節(jié)和原理我還不太懂，需要細(xì)看）

激活 MCH nerons (activation)

• MCH-Cre mice
• AAV9-CAG-FLEX-hM3Dq- mCherry
• 當(dāng)注射 CNO (clozapine-N-oxide) 時，hM3Dq受體被激活，產(chǎn)生動作電位。(相當(dāng)于MCH nerons被激活)

抑制 MCH nerons ( inhibition)

• MCH-Cre mice
• AAV9-CAG-FLEX-hM4Di-mCherry
• 當(dāng)注射 CNO 時，hM3Di受體被激活

(有關(guān)CNO, hM3Dq, hM4Di, DREADDs的總結(jié)放另一篇里面)

試驗流程如下：

1. 讓小鼠進行 NOR/CFC 記憶 (對應(yīng) Figure 1E 的 phaseⅠ)
2. 記憶10min 后注射 CNO，激活或抑制 MCH神經(jīng)元，同時注射生理鹽水作為對照
3. 休息1.5個小時，(小鼠有睡覺嗎？？)
4. 重新放回籠子(新物體/無電擊)，觀察小鼠行為，判斷小鼠記憶受損程度(遺忘)

結(jié)果：

1. 激活MCH 神經(jīng)元(hM3Dq+)后, 小鼠的 NOR/CFC 記憶收損，表現(xiàn)不如生理鹽水組
2. 抑制MCH 神經(jīng)元(hM3Dq+)后, 小鼠的 NOR/CFC 記憶提升，表現(xiàn)優(yōu)于生理鹽水組

Figure 1，hM3Dq+, hM3Di+, saline實驗組在NOR/CFC行為學(xué)中的表現(xiàn).png

上述結(jié)果表明：
MCH 神經(jīng)元的激活或抑制與 NOR/CFC 記憶相關(guān)(NOR是典型的hippocampus-dependent memories)，MCH 神經(jīng)元參與了遺忘的過程。

04. ablate MCH neurons ablated

化學(xué)抑制 MCH neurons 神經(jīng)元不夠徹底，而且 MCH neuron 也可能釋放其他神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生影響。
另一個問題是，需要多少時間就會遺忘。

To assess memory after a long retention period, MCH neurons were ablated by expressing diphtheria toxin A fragment (DTA) under control of the tet-off system (15). After doxycycline (DOX) removal from diet, almost all pro-MCH mRNA- expressing neurons were ablated [MCHN(?)] in contrast to mice fed with DOX-containing chow [MCHN(+)]

所以他們又做了將 LHA MCH 神經(jīng)元殺死的實驗。

他們引進了 tet-off 系統(tǒng)，大概的意思是在這個系統(tǒng)中小鼠的MCH neurons會表達 DTA(白喉毒素A片段)。當(dāng)DOX(強力霉素)能持續(xù)攝入時，MCH neurons正常生長，或 DOX 從小鼠的飲食中移除，小鼠的MCH neurons會被慢慢殺死，pro-MCH mRNA也不會再表達。(Figure 1J)

在殺死MCH神經(jīng)元后[MCHN(-)]，發(fā)現(xiàn)小鼠的 NOR記憶至少能維持48h (Figure 1J)。而且依賴于海馬的條件場景恐懼記憶(CFC)，空間記憶(spatial memory, the Morris water maze)也變得更好了(Figure 1KN)。但是，依賴于杏仁核(amygdala)的另一種恐懼記憶則不受影響(Figure 1M)。

說明 MCH神經(jīng)元影響的是依賴海馬的記憶(hippocampus-dependent)。

(關(guān)于 contextual-fear 和 cued-fear 放另一篇講)

Figure 1 [MCHN(-)] 對記憶的長期效應(yīng)以及不同場景下記憶的表現(xiàn).png

05. To further clarify a role for MCH neurons in memory

為了進一步說明 MCH neurons 的功能，研究者又引入了 光遺傳、膜片鉗電生理

光遺傳：

• MCH-tTA; TetO ChR2 mice (用這個轉(zhuǎn)基因鼠)
• channelrhodopsin2 (ChR2) (光刺激時激活 MCH 神經(jīng)元)
• wireless photoillumination (無線光激活器)
• (正文沒說用什么病毒，sm 里面估計有)
• (為什么用這種老鼠我也不清楚，以后再補上）

結(jié)果：Figure 2 A-C
Although activation during encoding or retrieval did not affect NOR memory, activation during the retention period significantly impaired memory.
圖中可以看出，在 encoding 和 retrieval 階段激活激活 MCH 神經(jīng)元對 NOR /CFC 記憶影響不大，但是在休息期( retention period)激活 MCH 神經(jīng)元，NOR /CFC 記憶能力顯著下降。 (也沒有說在 retention 的1小時里，小鼠是不是有在睡覺？)

注意 Figure 2 A-C 刺激的 MCH 神經(jīng)元的胞體

膜片鉗電生理：：

• hippocampal pyramidal CA1 neurons were patch clamped
• MCH nerve terminals were optogenetically stimulated
• 還是用上面的老鼠，切片，體外電生理記錄
• 膜片鉗夾海馬 CA1 區(qū)的錐形細(xì)胞，藍光激活MCH神經(jīng)元

這里刺激的是 MCH 神經(jīng)元的軸突末梢，這個軸突末梢在海馬區(qū)

結(jié)果：Figure 2 D-J
Blue light significantly decreased the firing frequency of hippocampal pyramidal neurons, whereas the frequency and amplitude of inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) were markedly increased, suggesting enhancement of g-aminobutyric acid–mediated (GABAergic) inhibitory inputs

藍光激活 MCH 神經(jīng)末梢后，海馬錐形神經(jīng)元細(xì)胞放電頻率下降，而抑制性的突觸后電流(IPSCs) 顯著增加。

說明：MCH 神經(jīng)元激活會增強海馬 CA1區(qū)錐形神經(jīng)元細(xì)胞的 GABA 能抑制性輸入 (???這里感覺邏輯有點怪，我是不是缺了什么背景知識)

Figure 2 optogenetics 和 patch clamp 鑒定 MCH 神經(jīng)元功能.png

最后感覺不過癮，在活動小鼠上刺激 MCH 神經(jīng)元的軸突末梢，并重復(fù) NOR/CFC試驗，結(jié)果一樣。在 retentoin期激活MCH 神經(jīng)元的軸突末梢會損失NOR/CFC記憶

06. To reveal MCH neuron activity across physiological sleep–wakefulness

雖然之前的研究表明，MCH 神經(jīng)元在 REM期活躍，但還是得證明一下。
所以他們又做了鈣成像試驗。

• EGG and EMG (分析小鼠是處于 wake,NREM,還是 REM 哪種狀態(tài))
• fiber photometry (纖維光度法？？估計就是來激活并記錄鈣信號的光纖)
• MCH-tTA mice (不知道為什么用這種老鼠)
• AAV9-TetO-GCaMP6 (鈣離子濃度探針，鈣離子濃度高，亮)

We inserted fiber optics into the LHA and recorded the population activity of MCH neurons in freely behaving mice

結(jié)果：Figure 3 A-D
不出意外地發(fā)現(xiàn)，MCH 在 REM 期更活躍 (Ca2+濃度高)
(雖然wake 時候也有，但是沒有 REM 那么顯著)

Figure 3 鈣成像試驗.png

？？ 為什么 wake 的狀態(tài)也有 MCH 神經(jīng)元在活躍

好氣哦！

所以他們又做了個單細(xì)胞水平的鈣成像試驗。

• MCH-Cre mice (我真不知道為什么要用這老鼠)
• AAV9-CMV-FLEX-GCaMP6f (GCaMP6f 另一個鈣離子探針，我不知道區(qū)別)
• microendoscopy (顯微內(nèi)窺鏡)

嗯，這些舒服了

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCH 神經(jīng)元里面有三個亞群：(Figure 3 E-H,J)

• 一部分只在 wake 的時候放電(興奮)
• 一部分只在 REM 期興奮
• 還有一小部分是在wake 和 REM 期都興奮的
• J 為單細(xì)胞層面，在不同的 wake-sleep stage 鈣離子活動狀態(tài)，和之前結(jié)果一致

而且從位置來看，這三類細(xì)胞隨機分布在 LHA(背側(cè)海馬)上 (Figure 3 I)

The presence of these subpopulations suggested the possibility of different roles for wake-active and REM-active MCH neurons in memory.

這里的實驗結(jié)果不僅解釋了為什么上一個試驗中，在 wake 的狀態(tài)也有 MCH 神經(jīng)元在活躍。
實際上，MCH神經(jīng)元在動物清醒時和食欲有關(guān)。這恰恰說明了 MCH 神經(jīng)元在清醒和睡眠狀態(tài)有不同的功能。

Figure 3 內(nèi)窺鏡鈣成像試驗.png

07. To reveal functional differences for REM-active versus wake-active MCH neurons in memory

(1). 首先證明MCH neurons 確實在睡眠時參與了記憶的調(diào)控
(2). 再證明MCH neurons 在 REM睡眠時 參與了記憶的調(diào)控

Figure 4 睡眠剝奪或者沒有 retention 期，[MCHN(-)]提高 NOR 記憶的效果消失了.png

所以他們想階段性地沉默 MCH 神經(jīng)元，看小鼠的 NOR 測試表現(xiàn)

• MCH- tTA mice
• AAV9-TetO-ArchT-EGFP (我好像發(fā)現(xiàn)一個規(guī)律，tTA和TetO搭配，cre 和 flex 搭配)
• ArchT (neural silencer Archaerhodopsin-T, 沉默神經(jīng)元活動)
• sleep–wakefulness states were automatically discriminated by analysis of EEG, EMG, and locomotor activity in real time (清醒睡眠階段自動檢測)

結(jié)果：(Figure 4F，其他圖都只是說這個試驗做的沒問題)

• 在 REM期抑制MCH 神經(jīng)元能顯著提高小鼠在 NOR 測試中的實驗，即在 REM期抑制MCH 神經(jīng)元能“抗遺忘”
• Figure 4G 是想說明，在抑制MCH 神經(jīng)元活動是，沒有影響小鼠的節(jié)律(wake-sleep stage)

Figure 4 State-dependent inhibition of MCH neurons disrupts memory.png

最后總結(jié)一下這篇文章用到的，但是我還不太懂的方法和技術(shù)，以后慢慢解讀。

1. 用哪種老鼠 (MCH-tTA mice, MCH-cre mice)
2. retrobeads (retrogradely transported beads) 是什么玩意？
3. DREADDs 技術(shù)
4. tet-off system
5. contextual-fear 和 cued-fear
6. 鈣成像、光遺傳、膜片鉗電生理，內(nèi)窺鏡，EEG&EMG (比較大，慢慢了解）

作者：發(fā)哥
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