? ? ? ? 前面我們介紹了mRNA display的方法原理，今天分享的這項研究就是基于mRNA display開發(fā)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作鑒定的PROPER-seq方法。? 傳統(tǒng)針對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的互作鑒定多依賴于蛋白質(zhì)質(zhì)譜的鑒定，而PROPER-seq將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的的鑒定轉(zhuǎn)換為RNA-RNA的嵌合鑒定，通過高通量測序可以實現(xiàn)大規(guī)模的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作鑒定。
三言兩語
1.SMART-display的開發(fā)：mRNA-display首先需要建立比較完整mRNA庫，在Proper-seq中，研究中基于SMART-seq模板置換的策略進(jìn)行mRNA文庫的構(gòu)建，然后通過PCR將T7 promoter，Puromycin linker hybridization sequence引入其中。
2. 使用T7 RNA polymerase進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，然后將含有Puromycin 修飾的linker（同時帶有biotin修飾）與轉(zhuǎn)錄RNA退火雜交，得到mRNA翻譯模板。采取體外翻譯策略進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，在蛋白質(zhì)合成至mRNA3'端時，Puromycin作為tRNA類似物參入其中，形成蛋白質(zhì)-mRNA嵌合復(fù)合物。
3.Bait文庫：將得到的蛋白質(zhì)-mRNA嵌合復(fù)合物通過Biotin固定在鏈霉親合素樹脂上，對蛋白質(zhì)上的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，同時依靠模板置換反應(yīng)引入BbvCI酶切位點（逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和用于模板置換的TSO為dsDNA），使用Bbv CI進(jìn)行酶切，獲得黏性末端，其可以與具有互補配對黏性末端的接頭進(jìn)行連接。
4.Prey文庫：將得到的蛋白質(zhì)-mRNA嵌合復(fù)合物通過Biotin固定在鏈霉親合素樹脂上，對蛋白質(zhì)上的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，同時依靠模板置換反應(yīng)引入BbvCI酶切位點（逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和用于模板置換的TSO為dsDNA），使用Bbv CI進(jìn)行酶切，獲得黏性末端。Prey文庫的Puromycin 修飾的linker上有一個脫氧次黃嘌呤核苷酸，使用Endonuclease V可以將文庫從鏈霉親合素樹脂上釋放，從而得到prey文庫。
5.將Bait文庫和Prey文庫混合孵育，依靠蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，Bait文庫捕獲相應(yīng)的Prey文庫，經(jīng)過T4 DNA連接酶將二者的進(jìn)行嵌合連接后，對文庫進(jìn)行片段化與捕獲，然后測序?；赗NA-RNA嵌合序列即可以推測蛋白-蛋白互作。
PS.PROPER-seq方法是一種純體外的實驗方法，使用的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)也是E.coli來源的，因此在解析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作時存在一定的局限性。
Ref
Johnson, K. L. et al. Revealing protein-protein interactions at the transcriptome scale by sequencing. Mol Cell (2021).
