第一天 數(shù)據(jù)下載
https://sra-explorer.info/?
流程：全部選中--add to collection--saved datasets--Aspera commands for downloading FastQ files
第二天 數(shù)據(jù)過濾
安裝conda
流程：下載minconda--配置倉庫（condarc）--安裝軟件
htop F5顯示進程
下載fastp
替換”rename 's///' *.gz“
打印文件名ls *.gz >test
打印文件中第一列 awk '{print 1 -o “clean/"
1".html -j"$1".json &" }' +file >run_fastp.sh
第三天 參考基因組下載
Ensemble下載基因組序列，注釋文件，蛋白序列
基因組序列：下載primary_assembly
toplevel里面包含搞不明白的DNA序列，不考慮
下載的數(shù)據(jù)，解壓 cat *.fa>genome.fa
注釋文件：chr.gtf全部定位到基因組了
abinitio從頭注釋，軟件預測，不靠譜
將gff轉變?yōu)間tf代碼：gffread -T -o file.gtf file.gff3
蛋白文件：awk '{print 1}' file
第三列中基因的個數(shù) awk '$3=="gene"' file |wc -l
第四天
軟件包FastX-toolkit用于裁斷基因每行的個數(shù)，80個，長度轉化
conda install fastx-toolkit
一行70個字符：fasta_formatter -i genome.fa -o genome_formater.fa -w 70
分析思路：
比對到基因組： Hisat2，STAR
比對到轉錄組; Bowties
飽和性曲線Saturation curve
6G：堿基數(shù)目 對于大多數(shù)動植物樣本，推薦20M reads X （150+150）=6000M
表達定量Quantification
subread --featureCounts進行定量
鏈特異性文庫可以區(qū)分正義量
標準化Normalization
TPM
比對
第一步（構建參考基因組）：參考基因組處理，構建index，排序。用于比對順利
輸入：基因組序列 輸出：構建好參考基因組 軟件：hisat2
代碼：`hisat2-build ../ref/genome.fasta ../ref/genome 1>hisat2-build.log 2>&1
第二步（比對）：
輸入：構建好的基因組，測序數(shù)據(jù) 輸出：比對結果（sam）軟件：hisat2
代碼
hisat2 --new-summary -p 10 -x ../ref/genome -U ../data/BLO_S1_LD1.fq.gz -S BLO_S1_LD1.sam --rna-strandness R 1>BLO_S1_LD1.log 2>&1
第三步（壓縮和排序）：
輸入：sam 輸出：bam 軟件：samtools sort
代碼
samtools sort -o BLO_S1_LD1.bam BLO_S1_LD1.sam
第四步：bam文件索引
輸入：bam 輸出bam.bai 軟件：
代碼:samtools index BLO_S2_LD3.bam
IGV：基因組文件 基因注釋文件 bam文件 sample.bam.bai
第一步：構建基因組：輸入基因組文件，基因組解釋文件。
第二步：將bam文件，bam.bai文件放于一個文件夾
在IGV中選擇File--loadfile--選擇bam文件即可，無需選擇bam.bai文件
第五天 定量
multiqc生成比對報告
samtools flagstat file.bam 查看比對情況
log文件更推薦查看比對
IGV查看比對情況：
HIsat2--stingtie：通過轉錄組拼接對于原來的基因結構優(yōu)化（不推薦）
PASA對原來的基因結構進行優(yōu)化
個體重測序本質是基因分型
群體重測序本質是等位基因頻率
表達定量：
輸入得到的bam文件，基因注釋文件，輸出：定量結果文件，軟件：Rsubread（featurecounts）R語言
安裝：(1)R包來源于于CRAN
install.packages("")
(2)R包來源于Bioconductor，查看安裝文檔
Rscript file.R
代碼：Rscript script/run-featurecounts.R -b ../1.Mapping/BLO_S1_LD1.bam -g ../ref/genes.gtf -o BLO_S1_LD1
-b:bam文件 -g:gtd文件 -o：輸出文件前綴
批量腳本：awk '{print "Rscript script/run-featurecounts.R -b ../1.Mapping/" $2".bam -g ../ref/genes.gtf -o "$2}' ../data/samples.txt
生成count
第六天 表達定量生成矩陣
