類器官模型是一種新興的體外模型，由具有干細(xì)胞性質(zhì)的起始細(xì)胞分裂和分化，并將多種類型的細(xì)胞自組裝的結(jié)構(gòu)，自組裝后的形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似。具有構(gòu)建周期較短、易于保存以及保留供體異質(zhì)性的特點(diǎn)

以往關(guān)于腫瘤的研究局限在細(xì)胞模型或者動物模型，但是這些模型都具有一定的限制。細(xì)胞系往往已經(jīng)失去原始供體的基因組特征，不具備個體異質(zhì)性，這給精確預(yù)測具體患者對特定藥物的敏感性帶來了困難。運(yùn)用人源腫瘤異種移植模型（patient-derived tumor xenograft，PDX）可以很好地解決這一問題，將供體的原位腫瘤移植入免疫缺陷動物，可最大化地保留供體的異質(zhì)性。但PDX模型的建立需要時間較長，且需要高昂的費(fèi)用，不利于高通量的藥物篩選。

類器官的出現(xiàn)是的我們可以在體外更加高效且真實(shí)的模擬腫瘤在體內(nèi)的各方面特性，以基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化提供了更加先進(jìn)的工具和橋梁

類器官的出現(xiàn)和發(fā)展

2009年，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上發(fā)表突破性成果，首次在外體培育出了結(jié)直腸上皮類器官。文中，研究者將腸上皮組織消化為腸隱窩結(jié)構(gòu)或單個Lgr5+干細(xì)胞，并包裹于基質(zhì)膠（matrigel）中，再加入含有表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Wnt信號通路相關(guān)蛋白R-spondin 1、Noggin蛋白的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由于Matrigel具有支撐作用，利用腸隱窩底部Lgr5+干細(xì)胞的增殖分化能力，消化獲得的腸隱窩結(jié)構(gòu)或單個Lgr5+干細(xì)胞能夠向各個方向生長，從而形成了包含腸上皮隱窩和絨毛樣結(jié)構(gòu)的3D組織球。經(jīng)免疫熒光染色、免疫組化及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其中包含了腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞以及Lgr5+干細(xì)胞等多種細(xì)胞種類，并具有腸上皮相似的結(jié)構(gòu)。

這些類器官模型的共同特點(diǎn)都包括：

1. 由相應(yīng)供體器官的多種特征性細(xì)胞構(gòu)成，相比單細(xì)胞模型能夠更好地模擬供體器官的特性；

2. 具有供體器官的部分功能，如排泄、過濾、收縮、神經(jīng)活動等；

3. 與供體器官具有相似的組織排列形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)。

類器官生物樣本庫的建立

利用手術(shù)切除的腫瘤樣本培養(yǎng)類器官，成功率較高可達(dá)90%，并且傳代后均可凍存，復(fù)蘇后的存活率可達(dá)80%以上
在沒有新鮮樣本的情況下，也可以將人結(jié)腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后，以梯度降溫的方式進(jìn)行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進(jìn)行復(fù)蘇和原代細(xì)胞提取，分別對細(xì)胞進(jìn)行2D和3D培養(yǎng)，證實(shí)了凍存對于細(xì)胞活力和生長速度均無顯著影響。但是新鮮組織提取的細(xì)胞依然是3D培養(yǎng)的最佳選擇
經(jīng)過HE染色，可發(fā)現(xiàn)類器官形態(tài)規(guī)則，很大程度上保留了供體組織的形態(tài)學(xué)特征?；蚪M檢測發(fā)現(xiàn)其突變率和供體類似。進(jìn)一步證明了類器官模型可以用于腫瘤患者個體水平的基因組及其功能的研究，且具有耗時短、高通量的特點(diǎn)，這是傳統(tǒng)細(xì)胞系模型及PDX模型所無法做到的。并且由于類器官可以很好地保留供體組織的異質(zhì)性，可以用于高通量的高敏感度的藥物敏感性檢測，為患者制定個性化的治療方案，具有很高的應(yīng)用價值。

培養(yǎng)方法

分離培養(yǎng)步驟

1. 人原代組織準(zhǔn)備：

注：涉及到人原代組織的研究必須符合所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府規(guī)定。
在收集人原代組織材料之前，必須得到所有受試者的知情同意。
目前培養(yǎng)的類器官主要來源于上皮細(xì)胞

1）收集人原代組織塊，按活檢部位和/或組織類型（比如正常組織和腫瘤組織）分開放在 50 mL 錐形管中，每管含有 45 mL 冰預(yù)冷的 adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基【「+++」表示含有以下三種試劑：adDMEM/F12 培養(yǎng)基 + 100 U/mL penicillin-streptomycin + 10 mM HEPES + 1× (vol/vol) GlutaMAX，在 4°C 保存 ≤ 1 月】。adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基中建議加入 10 μM ROCK 抑制劑（Tocris，Y-27632，貨號 1254），以提高細(xì)胞存活能力。將組織樣本保存在這種培養(yǎng)基中，置于 4°C，直至開始分離。

注：根據(jù)原代組織來源的不同，組織塊可在 4°C 下保存至多 72 小時
而不會造成類器官生長的明顯損失，但是建議盡快進(jìn)行下一步。

2）評估獲得的組織塊是否僅由上皮組成，還是包含脂肪或肌肉組織。如果包含脂肪或肌肉組織，在解剖顯微鏡下用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能去除非上皮成分。
注：非上皮組織可能會延長消化成單細(xì)胞的時間，或?qū)е逻^高估計(jì)具有類器官形成能力的（上皮）細(xì)胞數(shù)量。
3）在 10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀將組織切成1～3 mm3 的小塊。
4）根據(jù)腫瘤類型適當(dāng)消化組織。消化液一般以膠原酶為主（腸：II、IV 型；肺：I、II 型；肝：IV 型），濃度為 400～1,000 U/mL，附以分散酶，核酸酶 5～20 U/mL。消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，37 ℃ 預(yù)熱。在消化過程中添加 10 μM ROCK 抑制劑可提高生長效率。如下為結(jié)直腸消化液舉例可供參考。

結(jié)直腸消化液

仔細(xì)觀察消化情況，因?yàn)檫^度消化會顯著降低生長效率。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在觀察到細(xì)胞簇（由 2～10 個細(xì)胞組成）的混合物時，消化就完成了。
在開始培養(yǎng)新的組織類型時，建議在消化過程中取少量樣本并鋪板，
以確定這種特定組織的最佳消化時間。

5）當(dāng)混合物變得渾濁且剩余的組織碎片被破碎時，使用 P1000 移液器上下吹打 10～20 次，進(jìn)一步促進(jìn)組織破碎。從頂部加入 10 mL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基，并在** 4℃ 下以 200 g 離心 5 分鐘，對細(xì)胞進(jìn)行清洗。
6）將沉淀重懸在 10 mL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基中，并用 70～100 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾。
7）對重懸和過濾后的細(xì)胞進(jìn)行離心**，在 4°C 下以 200 g 離心 5 分鐘。

如果過篩后的細(xì)胞沉淀呈紅色，可能有血紅細(xì)胞污染
建議加入 5 mL 紅細(xì)胞裂解液 4°C 處理 5 分鐘。
完成裂解后，在 15 mL 管中加滿 PBS 清洗一次，然后在 4°C 下 500 g 離心 3 分鐘。

2.類器官培養(yǎng)

8）重懸包被：吸出上清液，將沉淀重懸在 BME（推薦 R&D Systems? Cultrex RGF，貨號 3536-005-02、BME001-10）中。BME 應(yīng)置于冰上，以防止其凝固，因而操作時應(yīng)當(dāng)迅速。BME 的用量取決于沉淀的量。大約 10,000 個細(xì)胞應(yīng)接種在 40 μL BME 中。

BME[Basement Membrane Extract]:基質(zhì)膠/基底膜提取物
提取于Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤，在37℃重新形成基底膜
其主要成分是laminin, collagen IV, entactin, HSPG等
還包含生長因子如TGF-beta，EGF，IGF，F(xiàn)GF，組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長因子
主要用于支持細(xì)胞生長和分化
也用于細(xì)胞粘附、血管新生、提取外細(xì)胞遷移/侵襲和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等。

切勿過度稀釋 BME【BME 應(yīng)當(dāng) > 70%（體積比）】
以確保能形成固化液滴

9）加樣：將類器官和 BME 的混合物滴在預(yù)熱的 24 孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板的底部，每滴約 10 μL。在每孔中放置 3～4 滴。

● 類器官一旦懸浮在 BME 中，應(yīng)盡快進(jìn)行鋪板，因?yàn)?BME 可能在管中或移液器吸頭中凝固。

● 培養(yǎng)板應(yīng)置于 37℃ 的加濕培養(yǎng)箱中，預(yù)熱過夜。
如果未正確預(yù)熱，BME 液滴會立即平鋪在培養(yǎng)板的表面，并且類器官更容易附著在培養(yǎng)板的底部。

10）凝固：將培養(yǎng)板置于 37°C、5%（體積比）CO2 加濕培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育 20～30 分鐘，使 BME 凝固。
11）培養(yǎng)基配置：準(zhǔn)備所需量的類器官培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方請見下表），并添加 10 μM ROCK 抑制劑和原代細(xì)胞抗生素 Primocin（100 μg/mL），然后將培養(yǎng)基置于 37°C 水浴中。對于頭頸部類器官，在人頭頸部類器官培養(yǎng)基中額外添加 0.5 μg/mL 卡泊芬凈（caspofungin）。

培養(yǎng)基培養(yǎng)示例

12）添加培養(yǎng)基：一旦 BME 液滴固化（30～60 分鐘），翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板并在每孔中小心加入 500 μL 類器官培養(yǎng)基。

切勿直接在 BME 微滴的頂部加入培養(yǎng)基，因?yàn)檫@可能會破壞微滴結(jié)構(gòu)。

13）培養(yǎng)：將培養(yǎng)板置于 37℃、5%（體積比）CO2 加濕培養(yǎng)箱內(nèi)。
14）每 2～3 天更換一次培養(yǎng)基，從各孔中小心吸出培養(yǎng)基，然后加入新鮮的預(yù)熱培養(yǎng)基。在前兩次傳代時，在培養(yǎng)基中添加 ROCK 抑制劑和Primocin。

● BME 微滴可能會從懸浮培養(yǎng)板上脫落，在培養(yǎng)基中[游動]。
  在這種情況下，我們建議對類器官進(jìn)行重新鋪板，不要使用 TrypLE 來解離類器官。
  密切監(jiān)控類器官的形成。理想情況下是在最初鋪板后的 12～14 天內(nèi)對類器官進(jìn)行首次傳代。

● 切勿過早傳代（Splitting）類器官，因?yàn)檫@可能會造成培養(yǎng)終止。

● 在第一次傳代時，確保培養(yǎng)物達(dá)到最佳密度
（根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，每 40 μL 培養(yǎng)物中含有 10,000 個細(xì)胞）。

3.傳代

→多久傳一次？
類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時間判斷。
一般在7-14天時進(jìn)行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次。
→傳多少次？
大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個月）
甚至有些類器官可以連續(xù)傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度。

1）上下吹打以破碎基底膜提取物（Basement Membrane Extract ，BME），然后將類器官懸浮物轉(zhuǎn)移至** 15 mL 錐形管中。
2）為了促進(jìn) BME 的去除，從頂部加入 10 mL 冰預(yù)冷的 adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基。
3）類器官在 4°C 條件下以 200 g 的轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘**。
吸出上清液，采用 TrypLE 或機(jī)械破碎來分解類器官，前者適用于頭頸部和緊實(shí)的乳腺、結(jié)腸、胰腺和肝臟類器官，后者適用于卵巢和囊性的乳腺、結(jié)腸、胰腺和肝臟類器官。

幾種消化液
1. 胰蛋白酶（trypsin）：胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織使用。
常用的胰蛋白酶液的濃度是0.25%和0.125% ，作用溫度是37℃或室溫，pH 7.4左右。-20℃凍存。
Trypsin 的缺點(diǎn)：
細(xì)胞損傷大－Trypsin 抑制劑需要將酶快速滅活，這會導(dǎo)致細(xì)胞損失或死亡。
冷凍保存－Trypsin 必須保存在－20 ℃，在經(jīng)過多次反復(fù)凍融或在 4 ℃ 長期保存后，穩(wěn)定性喪失。
批間差異大－Trypsin 為動物源性，批次之間差異性大。
2. Tryple 
細(xì)胞損傷?。璗rypLE 為非動物源性的消化酶，更純，對細(xì)胞損傷更小，提高種板效率。因?yàn)?TrypLe 作用細(xì)胞溫和，不需要 Trypsin 酶抑制劑?？梢灾苯佑?PBS 終止消化
室溫保存穩(wěn)定性高－TrypLe 可以穩(wěn)定的保存于室溫，節(jié)省了冷凍空間，同時提供即時可用的便利。
應(yīng)用范圍廣－TrypLE 是在有血清或無血清環(huán)境中培養(yǎng)的多種不同細(xì)胞系的理想選擇，可以直接替代您現(xiàn)有步驟中所用的 0.25% trypsin
室溫穩(wěn)定性高 - 工作儲存溫度可以為室溫保存 6 個月或 37 ℃ 一周后酶活性仍不丟失

? 在采用機(jī)械破碎時
將沉淀重懸在 3 mL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基中。
在移液器上裝上 P1000 帶濾芯吸頭和（不帶濾芯）P10 吸頭，上下吹打類器官懸液 30 次。
槍頭緊靠管的底部來產(chǎn)生更大壓力，有助于類器官的分解。
? 在采用 TrypLE 解離細(xì)胞時
將沉淀重懸在 1 mL TrypLE 中，上下吹打并在 37°C 條件下孵育，直至類器官分解。
在移液器上裝上 P1000 帶濾芯吸頭和（不帶濾芯）P10 吸頭，每 3～5 分鐘上下吹打 ≥ 10 次，以促進(jìn)類器官的分解。
密切監(jiān)控消化過程，盡量縮短 TrypLE 的孵育時間

● 使用 TrypLE 解離不要超過 15 分鐘，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致類器官生長不佳，甚至培養(yǎng)物損失。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在觀察到小塊細(xì)胞（由 2～10 個細(xì)胞組成）的混合物時，消化即已完成。
● 如果在為藥物篩選做準(zhǔn)備，則不完全消化產(chǎn)生的大塊細(xì)胞或完整的類器官碎片將導(dǎo)致類器官產(chǎn)量很低
因?yàn)樵谥苽渌幬锖Y選的類器官懸液時這些過大的細(xì)胞和碎片都會被過濾掉。

5） 在消化完成后，用 10 mL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基清洗。
6）第 8～11 步所述，將類器官沉淀重懸在 70%（體積比）BME 中，并以小液滴的形式鋪在預(yù)熱的培養(yǎng)板底部。在鋪板完成后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板并將其置于 37℃、5%（體積比）CO2 加濕培養(yǎng)箱中，孵育 30～60 分鐘。
7）將含有 10 μM ROCK 抑制劑的類器官培養(yǎng)基預(yù)熱至 37℃。
8）在 BME 微滴凝固后（30～60 分鐘），向各孔中小心加入預(yù)熱的培養(yǎng)基。
9）將培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 加濕培養(yǎng)箱中，直到類器官要用于藥物篩選?；蛘哂糜诤罄m(xù)的凍存和復(fù)蘇步驟。

4. 凍存

類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達(dá)到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進(jìn)行凍存。

10）在類器官傳代 2～3 天后，去除培養(yǎng)基，向各孔中加入 500 μL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基。利用 P1000 帶濾芯吸頭來分散 BME 微滴，然后將其轉(zhuǎn)移至冰預(yù)冷的 15 mL 錐形管中。

為確保在清洗時去除 BME，最多可將 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的 12 個孔合并在 15 mL 錐形管中。
如果要用更多的材料，則每次培養(yǎng)時使用多支管，之后在準(zhǔn)備類器官用于篩選時合并。

11）（可選）如果存在大量 BME，則在含有類器官的 15 mL 錐形管中加入冰預(yù)冷的 adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基，使其總體積為 12 mL，并用預(yù)先（用 adDMEM/F12+++）潤濕的 10 mL 血清移液管上下吹打，再置于冰上 10 分鐘。在此期間用 10 mL 血清移液管吹打數(shù)次。將樣本在冰上放置更長時間會進(jìn)一步溶解 BME。
12）類器官在 4°C 條件下以 200 g 的轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘。
13）吸出上清液，不要擾動沉淀。
14）加入所需體積的細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（例如商業(yè)化凍存試劑或 90% FBS + 10% DMSO），并用 P1000 移液器上下吹打，徹底重懸類器官。

24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中 4 個「原始」孔培養(yǎng)的類器官，對應(yīng)使用 500 μL 凍存培養(yǎng)基。

15）在每個無菌的凍存管中加入 500 μL 帶有重懸類器官的凍存培養(yǎng)基。
16）將凍存管保存在 -80℃ 冰箱中，24 小時后，取出凍存管，將其轉(zhuǎn)移至液氮罐中（約 -180℃）。

冷凍保存的類器官可在液氮罐中保存數(shù)年。

5. 復(fù)蘇

17）將帶有凍存類器官的凍存管從液氮罐轉(zhuǎn)移至干冰上。
18）對于每個要復(fù)蘇的凍存管，在室溫下準(zhǔn)備一個裝有 10 mL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基的 15 mL 錐形管。
19）將凍存管放入 37°C 水浴中，孵育 1～3 分鐘。

仔細(xì)監(jiān)控解凍情況，并在凍存試劑解凍后立即從水浴中取出凍存管。為了預(yù)留走到超凈臺所需的時間，可以考慮在仍有少量冰塊時取出凍存管。

20）在凍存管中逐滴加入 1 mL adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基，同時不斷混勻，然后將凍存管中的全部內(nèi)容物（包括類器官）轉(zhuǎn)移至 15 mL 錐形管中。在錐形管中加入 adDMEM/F12+++ 培養(yǎng)基，使其總體積為 10 mL。
21）類器官在 4°C 條件下以 200 g 轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘。
22）吸出上清液，不要擾動沉淀。
進(jìn)行6-9的鋪板

根據(jù)復(fù)蘇類器官的（溶液）體積，如果在清洗過程中凍存試劑未能達(dá)到至少 10 倍以上的稀釋，則應(yīng)增加額外的清洗步驟，以確保凍存試劑在鋪板前得到充分稀釋。

參考文章：
https://mp.weixin.qq.com/s/8X0KaMFVdhw4sBGIOnnshg
https://mp.weixin.qq.com/s/vMSHMs9XtdldIdh6c5i9vg
https://mp.weixin.qq.com/s/xwnhC8h5X6HEnKN1FowJMQ
耐藥微環(huán)境類器官https://mp.weixin.qq.com/s/vLTtcOUO12hFo9OGoRk6Mw