Microbial network
溶解的有機(jī)物和微生物群落之間的相互作用被微塑料和熱浪所改變
溶解性有機(jī)物(DOM)廣泛存在于天然水體中，通過微生物相互作用在河流碳循環(huán)和溫室氣體排放中發(fā)揮著重要作用。然而，關(guān)于DOM -微生物在響應(yīng)環(huán)境壓力方面的關(guān)聯(lián)的信息是有限的。河流環(huán)境是微塑料污染(microplastic,MP)的主要載體，全球熱浪(Heat waves,HW)正威脅著河流生態(tài)。在這里，通過MP暴露和HW模擬實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)DOM的分子量和芳香度與初始微生物群落密切相關(guān)。此外，MP來源的DOM作為決定因素調(diào)節(jié)微生物群落的豐度和多樣性，影響微生物演替軌跡，并與河流DOM競(jìng)爭(zhēng)微生物利用。模擬HWs增強(qiáng)了MP衍生的DOM競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，并促使微生物群落采用k策略來有效地倔強(qiáng)地利用碳。相對(duì)于單一環(huán)境應(yīng)激源暴露，MP污染和HWs聯(lián)合導(dǎo)致微生物網(wǎng)絡(luò)更加不穩(wěn)定。本研究探討了MPs和HWs如何驅(qū)動(dòng)河流DOM -微生物相互作用，有助于深入了解河流DOM的命運(yùn)和微生物群落演代過程，并縮小了了解受人類活動(dòng)和氣候變化影響的水生生態(tài)系統(tǒng)碳匯的知識(shí)差距。
highlights
? DOM解釋了微生物群落中43.17%的變異。
? 高分子量和芳香DOM驅(qū)動(dòng)了多樣化的微生物群落。
? MPs抑制DOM的生物利用度。
? HWs促進(jìn)了MP衍生的DOM的微生物利用。
? MPs和HWs提高了微生物對(duì)難降解碳的利用。
statistical analyses
? dismo包用于Aggregated boosted tree (ABT)分析，來研究物理和化學(xué)性質(zhì)對(duì)于細(xì)菌和真菌群落影響的重要性
? 基于現(xiàn)有研究，細(xì)菌中，α-Proteobacteria視為相對(duì)K策略者，β-proteobacteria, γ-proteobacteria, and Bacteroidetes視為典型策略者。真菌中，Basidiomycota 和 Ascomycota分別被認(rèn)為是r和 K策略者。比基于二者物種豐度計(jì)算r-K比例
conclusion
DOM是水生生態(tài)系統(tǒng)中最大的碳庫之一，其循環(huán)動(dòng)態(tài)受微生物的調(diào)控。然而，MP污染和HWs等不斷增加的環(huán)境壓力威脅著這一過程，迫切需要了解DOM與微生物之間的耦合如何響應(yīng)MP污染和HWs。我們發(fā)現(xiàn)高分子量和高芳香性的DOM有助于較高的微生物群落多樣性。MPs可作為影響微生物群落演替和抑制DOM生物利用度的決定性因素。雖然HWs的疊加增強(qiáng)了MP衍生碳源與DOM爭(zhēng)奪微生物群落利用的競(jìng)爭(zhēng)力，但HWs****也促進(jìn)了DOM****中頑固成分的降解和利用。微生物群落可以通過調(diào)節(jié)代謝模式和群落組成來積極應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力，但MPs****和HWs****的雙重作用降低了微生物群落的復(fù)雜性和穩(wěn)定性。MPs和HWs在DOM與微生物分解者相互作用中的影響作用，為了解氣候變化作用下河流的生化循環(huán)和碳匯提供了參考。
ARGs
預(yù)處理在厭氧污泥消化中處理抗生素耐藥基因中的作用
污泥是抗生素耐藥基因(ARGs)最重要的儲(chǔ)存庫之一，利用污泥會(huì)造成潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。目前，厭氧消化(AD)可以有效地同時(shí)實(shí)現(xiàn)資源回收和污染物去除，包括抗生素耐藥基因(ARGs)，并通過各種預(yù)處理來提高性能。近年來，大量文獻(xiàn)關(guān)注預(yù)處理對(duì)ARGs去除的影響，但得到的結(jié)果往往相互矛盾，必須全面了解預(yù)處理對(duì)ARGs去除的研究進(jìn)展和機(jī)理。本研究總結(jié)了提高AD效率和減少ARGs的各種預(yù)處理技術(shù)，研究了預(yù)處理聯(lián)合AD去除ARGs的潛在性能，并分析了影響ARGs命運(yùn)的潛在機(jī)制。結(jié)果表明，雖然熱水解預(yù)處理在預(yù)處理過程中對(duì)****ARGs****的還原效果最好，但在隨后的AD****過程中，ARGs****會(huì)出現(xiàn)明顯的反彈。相反，臭氧預(yù)處理和堿預(yù)處理對(duì)預(yù)處理階段ARGs豐度無顯著影響，但在后續(xù)AD中可提高15.6~24.3%的ARGs去除率。從效率和經(jīng)濟(jì)效益來看，游離亞硝酸鹽預(yù)處理是一種可行的方法，其甲烷產(chǎn)量和ARGs去除率分別可提高27%和74.5%。目前，在預(yù)處理和AD過程中，決定ARGs命運(yùn)的因素包括微生物群落的轉(zhuǎn)移、移動(dòng)遺傳元件(MGEs)和環(huán)境因素。全面了解ARGs的命運(yùn)與預(yù)處理技術(shù)之間的關(guān)系，有助于系統(tǒng)評(píng)價(jià)各種預(yù)處理技術(shù)，促進(jìn)新興有效的預(yù)處理技術(shù)的發(fā)展。此外，考慮到預(yù)處理的有效性、經(jīng)濟(jì)效率和環(huán)境安全性，我們呼吁應(yīng)用宏基因組和機(jī)器學(xué)習(xí)等現(xiàn)代分析方法來優(yōu)化預(yù)處理?xiàng)l件并揭示潛在機(jī)制。
highlight
? 綜述了不同預(yù)處理對(duì)甲烷產(chǎn)率和ARGs脫除效果的影響。
? ARGs可以被幾次預(yù)處理去除，但在隨后的AD過程中反彈。
? 通過預(yù)處理去除ARGs取決于操作參數(shù)和污泥性質(zhì)。
? FNA（Free nitrous acid）預(yù)處理是同時(shí)回收資源和去除ARGs最有希望的選擇。
? 宏基因組和機(jī)器學(xué)習(xí)的應(yīng)用將有利于未來的研究。
卑爾根港的海水是攜帶毒力基因的共軛多藥耐藥質(zhì)粒的存儲(chǔ)庫
水生環(huán)境在臨床相關(guān)抗生素耐藥基因(ARGs)和病原體的傳播中起著重要作用。關(guān)于在海洋環(huán)境中，特別是在挪威，臨床相關(guān)的獲得性耐藥基因的流行情況的知識(shí)有限。本研究的目的是利用綠色熒光蛋白****(GFP)****標(biāo)記的大腸桿菌菌株作為受體，通過外源質(zhì)粒捕獲，研究卑爾根港海水中自傳抗性質(zhì)粒的存在和特征。我們從處理的13個(gè)樣品中的4個(gè)樣品中獲得了抗氨芐西林和頭孢噻肟的轉(zhuǎn)偶聯(lián)物。利用Illumina MiSeq和Oxford Nanopore MinION平臺(tái)對(duì)基于抗生素敏感性模式選擇的9種轉(zhuǎn)偶聯(lián)物進(jìn)行測(cè)序。在這些transconjugants中檢測(cè)到10個(gè)不同的質(zhì)粒(從35 kb到136 kb不等)，屬于不親和組IncFII/IncFIB/Col156、IncFII、IncI1和IncB/O/K/Z。質(zhì)粒p1A1 (IncFII/IncFIB/Col156, 135.7 kb)攜帶耐藥基因blaTEM-1、dfrA17、sul1、sul2、tet(A)、mph(A)、aadA5、aph(3″)-Ib和aph(6)-Id，對(duì)6類不同的抗生素具有耐藥性。質(zhì)粒p1A4攜帶blaCTX-M-55、lnu(F)、aadA17和aac(3)-IId。頭孢菌素酶blaCMY-2在質(zhì)粒上被檢測(cè)到，質(zhì)粒是從當(dāng)?shù)睾Ｑ笏屦^廢水影響的區(qū)域捕獲的。除ARGs外，一些質(zhì)粒還攜帶毒力因子，如腸毒素、粘附因子和鐵載體。我們的研究表明，卑爾根港海水中存在臨床重要的多藥耐藥綴合質(zhì)粒，這些質(zhì)粒有可能轉(zhuǎn)移到人類微生物群中。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)，需要按照世界衛(wèi)生組織的建議，對(duì)環(huán)境中的抗生素耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，特別是在挪威等低流行率的國(guó)家。
highlight
? 捕獲了10個(gè)不同的共軛多藥耐藥質(zhì)粒(大小:35-136 kb)。
? 質(zhì)粒屬于IncFII、IncI1和IncB/O/K/Z不相容組。
? 來自海水的質(zhì)粒還攜帶senB和artA等毒力因子。
? 攜帶CTX-M-55的接合質(zhì)粒屬于IncI1-I(α)族。
? 所有質(zhì)粒都能在腸桿菌科中繁殖。
conjugation assay
GFP標(biāo)記的E.coli作為受體，海水中的微生物作為供體。二者分別再M(fèi)H broth中過夜培養(yǎng)、離心重懸，調(diào)節(jié)OD600到0.6供試。
1mL的供體和受體菌液混合，過0.22μm濾膜，濾膜上的菌體于MH平板涂布，30攝氏度培養(yǎng)4小時(shí)。將平板上接合體加入PBS緩沖液中，再加入玻璃珠打破結(jié)合狀態(tài)，隨后稀釋涂布，過夜培養(yǎng)。
plasmids annotation
在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)使用原核基因組注釋管道(PGAP) v.4.13對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行注釋。使用CGView獲得質(zhì)粒的概況。使用PlasmidFinder 2.0對(duì)質(zhì)粒復(fù)制子進(jìn)行分型。使用ResFinder 4.1檢查arg的存在和綜合抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(CARD)。使用毒力因子數(shù)據(jù)庫(VFDB)中的VFanalyzer分析毒力基因。通過檢索注釋質(zhì)粒的GenBank文件，檢測(cè)生物殺菌劑/金屬抗性基因(BMRGs)和偶聯(lián)轉(zhuǎn)移基因。
metagenome
腸道宏基因組具有中重度哮喘的代謝和抗生素耐藥性特征
哮喘是一種常見的過敏性氣道疾病，在生命早期與人類微生物組有關(guān)。嬰兒腸道菌群的組成和功能都與哮喘風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但老年哮喘患者腸道菌群的功能改變?nèi)匀皇且粋€(gè)重要的知識(shí)鴻溝。在這里，我們對(duì)59名健康患者和36名中度至重度哮喘患者的95份糞便樣本進(jìn)行了全宏基因組鳥槍測(cè)序，以表征6歲及以上兒童和成人腸道微生物群的宏基因組。同源功能的圖譜顯示，即使考慮到其他重要的臨床人口統(tǒng)計(jì)學(xué)因素，哮喘對(duì)宏基因組含量變異的貢獻(xiàn)率也達(dá)到2.9%。差異豐度分析顯示，長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)代謝途徑富集，這在哮喘患者的氣道平滑肌和免疫反應(yīng)中已被發(fā)現(xiàn)。我們還觀察到哮喘患者中抗生素抗性基因(ARGs)的豐富度增加。一個(gè)差異豐富的ARG是大環(huán)內(nèi)酯類耐藥標(biāo)記物ermF，它與脆弱擬桿菌毒素顯著共存，表明腸毒素脆弱擬桿菌、抗生素耐藥和哮喘之間可能存在關(guān)系。最后，我們發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)隊(duì)列中同時(shí)出現(xiàn)的多種毒力因子(VF)和ARG對(duì)表明，在哮喘患者的糞便微生物群中，毒力和抗生素耐藥性特征是共同選擇和保持的。總的來說，我們的研究結(jié)果顯示，通過LCFA生物合成基因的功能改變，以及中至重度哮喘患者腸道微生物群中抗生素抗性基因的增加，可能對(duì)哮喘的管理和治療產(chǎn)生影響。
read-based metagenome profiling
為了獲得關(guān)于糞便樣本宏基因組含量的功能信息，使用HUMAnN v3.0.0對(duì)默認(rèn)參數(shù)的過濾reads進(jìn)行處理。HUMAnN用于鑒定分類身份的標(biāo)記基因數(shù)據(jù)庫為ChocoPhlAn v201901b，用于鑒定功能的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為UniRef90完整數(shù)據(jù)庫v201901b。對(duì)95個(gè)樣本中至少16個(gè)樣本中存在的Uniref90基因進(jìn)行Alpha多樣性分析和KEGG直系同源基因的雙樣本檢驗(yàn)，這是允許Bonferroni校正的Wilcoxon p值低于0.0001的最低臨界值。通過將UniRef90基因映射到MetaCyc數(shù)據(jù)庫，HUMAnN用于確定宏基因組通路的豐度。我們使用Wilcoxon雙樣本檢驗(yàn)對(duì)出現(xiàn)率至少為10%的通路進(jìn)行了差異豐度分析。
為了鑒定MARS糞便宏基因組中存在的抗生素耐藥性基因，使用ShortBRED-identify (v0.9.4)與綜合抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫CARD和毒力因子數(shù)據(jù)庫VFs。ShortBRED-Quantify使用默認(rèn)參數(shù)在過濾后的讀取上運(yùn)行。在95個(gè)樣本中，豐度大于0的arg或vf在不到7個(gè)樣本中被排除在下游分析之外。這一臨界值是使用二項(xiàng)分布確定的，以保持95%的置信度，即富集不是由于隨機(jī)機(jī)會(huì)(使用stats::binom in R)。在比較毒力因子譜和抗生素耐藥性基因譜的分析中，任何具有相同名稱的基因都被排除在抗生素耐藥性列表之外，只被視為毒力因子，以防止由于相互關(guān)聯(lián)而產(chǎn)生虛假結(jié)果。只有一個(gè)基因符合這一標(biāo)準(zhǔn):ugd (UDP -葡萄糖6-脫氫酶)。
微生物組成用HUMAnN管道中包含的MetaPhlAn 3.0進(jìn)行測(cè)定。R中使用MaasLin(Maaslin2_1.5.1)，將哮喘設(shè)為固定效應(yīng)，將年齡組和種族設(shè)為隨機(jī)效應(yīng)，尋找與哮喘相關(guān)的任何分類級(jí)別的類群。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者腸道病毒群的改變
在大量宏基因組數(shù)據(jù)集中，SLE(Systemic lupus erythematosus)患者的腸道病毒多樣性顯著降低，但在VLP(virus-like particle)宏基因組數(shù)據(jù)集中，這種變化不顯著。此外，與健康對(duì)照組相比，在SLE患者中觀察到整體腸道病毒組成的顯著改變和病毒家族組成的顯著變化，這兩種技術(shù)都觀察到。我們鑒定了408個(gè)vOTUs(177個(gè)sles富集和231個(gè)對(duì)照組富集)，在主體病毒體中患者和對(duì)照組之間具有顯著的相對(duì)豐度差異，在VLP病毒體中鑒定了18個(gè)vOTUs(1個(gè)對(duì)照組富集中有17個(gè)sles富集)。富含sles的vOTUs包括許多虹吸病毒科、微病毒科和粗類病毒，并經(jīng)常被預(yù)測(cè)感染擬桿菌科、副桿菌科和瘤胃球菌_E，而富含對(duì)照組的vOTUs包含大量虹吸病毒科和肌病毒科成員，并被預(yù)測(cè)感染普雷沃氏菌和Lachnospirales_CAG-274。我們探索了腸道病毒和細(xì)菌之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)一些Lachnospirales_CAG-274和Hungatella_A噬菌體可能在病毒-細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，我們探索了用于疾病識(shí)別的腸道病毒特征，并實(shí)現(xiàn)了接受者操作特征曲線(AUC)下的面積大于0.95，這表明腸道病毒在預(yù)測(cè)SLE中的潛力。以上結(jié)果證實(shí)了SLE患者腸道病毒群的病毒多樣性和分類組成的改變。對(duì)SLE病因?qū)W和腸道病毒群落的進(jìn)一步研究將為治療和預(yù)防SLE和其他自身免疫性疾病開辟新的途徑。
Identification and clustering of viral sequences
High-quality clean reads for each bulk or virome metagenomic sample were performed for de novo assembly via MEGAHIT (25) with a broad range of k-mer sizes (–k-list 21,41,61,81,101,121,141). For bulk metagenome samples, all assembled contigs with a length ≥2 kbp were firstly assessed by using CheckV (26), and the non-viral contigs were removed if their viral gene count was less than the number of microbial genes. Then, we identified potential viral sequences from the remaining contigs based on two criteria: 1) contigs with P-value <0.01 and score >0.90 in DeepVirFinder (27); and 2) contigs identified as viruses by VIBRANT (28) with default options (-meta mode). Low-quality or “not-determined” viral contigs assessed by CheckV were further removed to avoid contamination. For virome metagenome samples, we identified potential viral sequences from the assembled contigs with length ≥2 kbp based on the following criteria: 1) contig whose viral gene was more than the number of microbial genes in CheckV (26); 2) contig with P-value <0.01 and score >0.90 in DeepVirFinder (27); and 3) contig identified as a virus by VIBRANT (28) with default options (-virome mode). According to the previous study (29), we searched for bacterial universal single-copy orthologs (BUSCO) (30) within viral sequences using hmmsearch (31) with the default options and calculated the ratio of the number of BUSCO to the total number of genes in each viral sequence (referred to as the BUSCO ratio). After removing highly contaminated viral sequences with a ≥5% BUSCO ratio, the remaining viral sequences were considered the final viral sequences for each sample.
The viral sequences were de-replicated using the following procedures: 1) all viral sequences were aligned pairwise using BLASTN with the options ‘-evalue 1e-10 -word size 20 -num alignments 99999’; 2) viral sequences that shared 95% nucleotide identity across 75% of the sequence were clustered into a viral operational taxonomic unit (vOTU) using in-house scripts.
Taxonomy assignment and host prediction of viruses
Viral protein-coding genes were called from the viral sequences using Prodigal (32). Taxonomic annotation of viral sequences was carried out based on protein sequence alignment to the combined database derived from the Virus-Host DB (downloaded in May 2021) (33), crAss-like protein sequences from Guerin’s study (34), and viral protein sequences from Benler’s study (35). To implement accurate family-level taxonomy, we first aligned proteins of viral sequences from NCBI RefSeq against the combined database using DIAMOND (36) with the parameters ‘–query-cover 50 –subject-cover 50 –id 30 –min-score 50 –max-target-seqs 10’. A viral sequence was annotated to the viral family level when over a quarter of its proteins were matched to the same family.
The virus-host prediction was performed using two bioinformatic methods that included prophage prediction and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-spacer matches. For prophage prediction, the viral sequence was blasted against the gut prokaryotic genes from the comprehensive unified human gastrointestinal genome (UHGG) database (37), and a host was assigned if the viral sequence matched the host genome at 90% nucleotide identity and 30% viral coverage (29). For CRISPR-spacer matches, we first predicted CRISPR spacer sequences from the UHGG genomes using MinCED (38) with the option ‘-minNR 2’, and then assigned a host to the virus if the host CRISPR spacer sequence was matched to the viral genome (bit-score ≥45) using BLASTN with options ‘-evalue 1e-5 -word_size 8 -num_alignments 99999’ (29).
