本次閱讀的文章是今天發(fā)表在《Nature》上的《Fertilized egg cells secrete endopeptidases to avoid polytubey》一文，通訊作者是武漢大學(xué)的孫蒙詳老師。

在動(dòng)物受精之后，為了防止多精受精，其中一種方式即通過(guò)釋放卵細(xì)胞特異表達(dá)的金屬蛋白o(hù)vastacin通過(guò)剪切透明帶的糖蛋白ZP2以阻止其他的精細(xì)胞穿過(guò)透明帶。植物中通常也不會(huì)出現(xiàn)多根花粉管進(jìn)入胚珠的現(xiàn)象，那么植物中這種polytubey的阻止是如何實(shí)現(xiàn)的呢？在先前的研究中，受精前NO對(duì)于花粉管吸引物質(zhì)的Atlure1的修飾可以阻止在珠孔處多花粉管進(jìn)入，而受精后中央細(xì)胞與宿存助細(xì)胞的融合亦有助防止多花粉管進(jìn)入，但是是否在受精后，植物是否可以像動(dòng)物一樣釋放一類蛋白酶實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的切割來(lái)快速達(dá)到防止多精受精仍不清楚。

為了理清這一問(wèn)題，孫老師組從擬南芥中挑選了兩個(gè)特異在卵細(xì)胞表達(dá)的且具備分泌活性的基因，命名為EGG CELL-SPECIFIC1 (ECS1) 和 ECS2。ECS1 和 ECS2屬于A1類天冬氨酸肽鏈內(nèi)切蛋白酶：含有一個(gè)信號(hào)肽以及兩個(gè)酶活位點(diǎn)DTGS 和 DSGT，通過(guò)構(gòu)建兩個(gè)基因的表達(dá)模式可以發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)蛋白特異表達(dá)在成熟的卵細(xì)胞中，在受精后表達(dá)迅速消失，原位雜交的數(shù)據(jù)更是證明了這一點(diǎn)。

為了探究ECS1和ECS2的功能，作者利用T-DNA突變體構(gòu)建了ecs1/2的雙突（單突無(wú)育性缺陷），發(fā)現(xiàn)多花粉管進(jìn)入的比例約為10%，這可以被ECS1或是ECS2所回補(bǔ)，為了進(jìn)一步探索配子融合的過(guò)程有無(wú)缺陷，利用精細(xì)胞的marker授粉雙突，發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯融合缺陷，但是在受精4-6h后能夠檢測(cè)到約16%的胚珠中會(huì)出現(xiàn)多對(duì)精細(xì)胞的現(xiàn)象，進(jìn)一步暗示多花粉管阻礙出現(xiàn)問(wèn)題。

Egg cell-specific ECS1 and ECS2 act together to prevent polytubey inArabidopsis

為了進(jìn)一步詳細(xì)分析ECS1/2的分泌與多花粉阻礙的關(guān)系，利用多個(gè)marker進(jìn)行探索，可以發(fā)現(xiàn)在未受精前ECS1/2-mCit主要在卵細(xì)胞膜頂部極性定位，但是在受精后，信號(hào)能夠彌散至降解的助細(xì)胞處。隨后利用gcs-1受精缺陷的突變體，證明只有受精后能夠啟動(dòng)ECS1/2擴(kuò)散的過(guò)程，而利用一個(gè)頻繁發(fā)生單受精的突變體gex2，發(fā)現(xiàn)ECS1/2的擴(kuò)散不依賴于精細(xì)胞與中央細(xì)胞的融合而依賴精卵的融合。而截短形式（缺乏信號(hào)肽）的ECS1/2在受精不能被釋放出卵細(xì)胞，說(shuō)明ECS1/2的分泌活性對(duì)于功能至關(guān)重要。

ECS proteins are secreted from the egg cell after successful sperm–egg cell fusion

那么ECS1/2是如何實(shí)現(xiàn)對(duì)多花粉管的阻礙的呢？結(jié)合ECS彌散的位置，作者猜測(cè)很可能會(huì)作用于花粉管吸引物質(zhì)。通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)作者確認(rèn)了ECS1/2與AtLURE1.2的互作，進(jìn)一步通過(guò)煙草以及哺乳細(xì)胞的共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ECS1/2會(huì)特異性降解Atlure1.2。

The LURE1.2 pollen tube attractant is a direct target and substrateof ECS1 and ECS2 endopeptidases

為了確定ECS1/2切割的底物，作者體外合成了Atlure1.2的8個(gè)肽段，substrates 3, 5 和 7能夠被剪切，有趣的是底物3在AtLURE1.1-5非常保守，但是在1.7-1.8以及XIUQIUs中不存在。為了在體內(nèi)證明ECS1/2與AtLURE1s之間的關(guān)系，在ecs1/2 中發(fā)現(xiàn)AtLURE1的表達(dá)在受精后并不如WT中一樣減少。因此ECS1/2對(duì)于AtLURE1s在受精后的降解至關(guān)重要。

ECS1 and ECS2 endopeptidases interact with LURE1.2 and cleave it as a substrate

為了證明ECS1/2-AtLURE1s的信號(hào)通路對(duì)于防止多花粉管進(jìn)入胚珠過(guò)程的重要性，將ECS1/2異位表達(dá)在助細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AtLURE1的表達(dá)降低，花粉管的吸引出現(xiàn)異常（類似于atlure1s），此外如果異位表達(dá)截短的ECS1/2或是卵細(xì)胞特異表達(dá)的subtilisin-like protease SBT4.13對(duì)于表型無(wú)影響。最后為了突出內(nèi)切酶活性對(duì)于功能的影響，通過(guò)體外將酶活突變的ECS1/2與AtLURE1的肽段孵育或是在ecs1/2回補(bǔ)酶活突變的ECS1均無(wú)作用，說(shuō)明了酶活對(duì)功能的重要性。

Mutation of active sites of ECS1 and ECS2 endopeptidases leads to polytubey

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)卵細(xì)胞特異表達(dá)的天冬氨酸蛋白酶ECS1/2，在受精后釋放能夠特異性降解花粉的吸引物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)多花粉管阻礙的快反應(yīng)。

有些問(wèn)題：

1.ecs1/2 是否敗育。

2.ploytubey的表型過(guò)弱（不到20%）

3.什么信號(hào)觸發(fā)ECS1/2的分泌。