PCR是一個(gè)很基礎(chǔ)的試驗(yàn)，設(shè)計(jì)引物更是常用。引物（Primer）——也稱為寡核苷酸（Oligonucleotides）或短鏈核苷酸（Oligos）——是用于啟動(dòng)DNA合成的短的單鏈核酸。在PCR反應(yīng)中，它們與模板DNA的正鏈和負(fù)鏈結(jié)合，兩者之間是目的擴(kuò)增序列。

1. 上下游引物的Tm 值（Melting temperature）是什么？

上下游引物的Tm值（Melting temperature，熔解溫度）是指在特定的條件下，引物與其互補(bǔ)序列形成雙鏈DNA時(shí)的中點(diǎn)溫度。在這個(gè)溫度下，大約有一半的引物分子與其互補(bǔ)序列結(jié)合形成雙鏈，而另一半則保持單鏈狀態(tài)。

Tm值是設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)的一個(gè)重要參數(shù)，因?yàn)樗绊懼鳳CR反應(yīng)中引物與模板DNA的特異性結(jié)合。理想情況下，一對(duì)引物的Tm值應(yīng)該相近，這樣可以確保在PCR過程中引物與模板DNA的有效結(jié)合，減少非特異性擴(kuò)增。

計(jì)算引物Tm值的常用公式是：Tm（°C）=2(A+T)+4(G+C)

其中，A、T、G和C分別代表引物序列中腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的數(shù)量。

需要注意的是，Tm值也受到其他因素的影響，如離子強(qiáng)度、鎂離子濃度、引物長(zhǎng)度和GC含量等。因此，實(shí)際的Tm值可能需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化來(lái)確定。一些在線工具和軟件可以幫助預(yù)測(cè)引物的Tm值，但最終的Tm值確定通常需要通過實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證（在公司購(gòu)買的引物，一般管子上會(huì)標(biāo)明Tm）。

2. 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，比如二聚體（Primer Dimer）和發(fā)卡結(jié)構(gòu)

由于DNA單鏈分子通過自身回折使得互補(bǔ)的堿基對(duì)相遇，形成氫鍵結(jié)合而成的，稱為發(fā)卡結(jié)構(gòu)。引物二聚體其實(shí)就是一對(duì)引物或者引物自身的 3’ 端部分堿基互補(bǔ)結(jié)合，在 Taq 酶的作用下從 3’ 末端延伸所形成的小分子量的雙鏈 DNA 片段。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量避免這種二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖1 引物二級(jí)結(jié)構(gòu)?從左到右為發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物自身形成的二聚體和一對(duì)引物形成的二聚體（https://www.integra-biosciences.com/belgium/en/blog/article/how-design-primers-pcr）

圖2?引物二聚體在凝膠電泳圖上的表現(xiàn)（https://geneticeducation.co.in/what-are-primer-dimers-a-beginners-guide/）

3. 關(guān)于堿基的一些基礎(chǔ)知識(shí)

圖3?堿基配對(duì)圖?T和A之間兩個(gè)氫鍵、CG之間三個(gè)氫鍵（https://www.integra-biosciences.com/belgium/en/blog/article/how-design-primers-pcr）

有時(shí)會(huì)設(shè)計(jì)不匹配的引物（簡(jiǎn)并引物）。不匹配是指引物上的堿基與目標(biāo)序列不互補(bǔ)，有時(shí)必須這么設(shè)計(jì)。例如，當(dāng)執(zhí)行多模板PCR以從不同細(xì)菌中擴(kuò)增一組相似的目標(biāo)序列時(shí)，使用一對(duì)引物。

簡(jiǎn)并引物在其某些位置上具有幾種不同的核苷酸。例如，在某一位點(diǎn)上，可以擁有A和T的等濃度的引物，而不是單一的A。用于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的不同核苷酸組合的代碼如下。

圖4 簡(jiǎn)并堿基表

4.?引物長(zhǎng)度

引物長(zhǎng)度（Primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38 bp，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74°C，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

5. 引物的修飾

引物的5’端決定著PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3 等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA 序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。

6. 引物的GC含量和Tm

GC 含量（Composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大，一般在40-60%之間。Tm通常在50-60℃之間，且正向和反向引物的熔解溫度應(yīng)該相差不超過5°C。

7. 引物的特異性

引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST 檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一，有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC 含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

8.?引物的其他設(shè)計(jì)注意點(diǎn)

（1）引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C（三鍵連接更緊密），因?yàn)檫@樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤擴(kuò)增。

（2）由于密碼子具有簡(jiǎn)并性，第三位堿基常會(huì)發(fā)生改變。引物3'端如果終止于密碼子的第三位，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性和效率。

（3）引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T 時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T 之間。PCR擴(kuò)增目的不同，引物設(shè)計(jì)的選擇不同。

9. 目標(biāo)條帶長(zhǎng)度

普通PCR的目標(biāo)條帶長(zhǎng)度為100-3000 bp，定量PCR的產(chǎn)物長(zhǎng)度一般在75-150 bp之間。

10. 目標(biāo)條帶（擴(kuò)增產(chǎn)物）的其他注意

選擇擴(kuò)增片段時(shí)，應(yīng)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇DNA模板區(qū)域。當(dāng)然有時(shí)候，這個(gè)目標(biāo)條帶區(qū)域是沒法更換的，不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP 取代dGTP 對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。