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題目：Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancerr 時間：2021年10月 期刊：Cancer Cell ((IF: 31.7) DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.010
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在三陰性乳腺癌（TNBC）中，將化療與檢查點抑制劑相結(jié)合的好處仍然不是很清楚。作者利用單細(xì)胞RNA和ATAC測序來檢查22名患有晚期TNBC的患者的免疫細(xì)胞動力學(xué)，這些患者的治療方法是紫杉醇或與阿特珠單抗 (Atezolizumab)的結(jié)合。我們證明，高水平的基底CXCL13+ T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的炎性特征有關(guān)，可以預(yù)測對組合療法的有效反應(yīng)。在反應(yīng)靈敏的患者中，淋巴組織誘導(dǎo)（LTi）細(xì)胞、濾泡B（Bfoc）細(xì)胞、CXCL13 +T細(xì)胞和常規(guī)1型樹突狀細(xì)胞（cDC1）在聯(lián)合治療后協(xié)同增加，但在紫杉醇單一療法后則減少。我們的數(shù)據(jù)突出了CXCL13 +T細(xì)胞在有效應(yīng)對抗PD-L1療法方面的重要性，并表明通過紫杉醇療法減少這些細(xì)胞可能會損害伴隨阿特珠單抗 (Atezolizumab)進(jìn)行TNBC治療的臨床結(jié)果。
樣本信息和實驗設(shè)計
研究人員收集了來自22例TNBC患者（11例接受阿替利珠單抗聯(lián)合紫杉醇化療，11例接受紫杉醇單藥化療）治療前和治療后的78例配對樣本，通過整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、T細(xì)胞受體序列測序和染色質(zhì)可及性測序，構(gòu)建了TNBC患者腫瘤微環(huán)境和外周血來源免疫細(xì)胞的高分辨率轉(zhuǎn)錄組和表觀組動態(tài)圖譜。該研究在單細(xì)胞水平上對來自接受兩種治療方案的TNBC病人的腫瘤組織和外周血的免疫細(xì)胞進(jìn)行刻畫，系統(tǒng)比較了響應(yīng)患者和非響應(yīng)患者的腫瘤微環(huán)境及外周血免疫特征，闡明了免疫細(xì)胞在不同治療方案下的動態(tài)變化，揭示了anti-PD-L1免疫治療聯(lián)合紫杉醇化療在TNBC中的作用機(jī)制。
單細(xì)胞測序技術(shù)
scRNA-seq(10x Genomics) , scTCR-seq和scATAC-seq
部分分析結(jié)果
使用不同療制治療的晚期TNBC患者的免疫細(xì)胞動力學(xué)
經(jīng)過質(zhì)量過濾，獲得了489，490個高質(zhì)量免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中包括骨髓細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞（ILCs）、T細(xì)胞和B細(xì)胞（圖1B）。根據(jù)Pi分析，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞是最突出的免疫細(xì)胞類型，可以預(yù)測對兩種治療方案（圖1C）的有利反應(yīng)。為了在人類TNBC中生成一個全面的免疫細(xì)胞圖集，進(jìn)一步將來自血液或腫瘤的每一個主要免疫室單獨(dú)隔離（STAR方法）。揭示了具有不同分子特征的異質(zhì)免疫細(xì)胞亞型，表明它們具有獨(dú)特的細(xì)胞特征（圖1B、1D）。
腫瘤滲透T細(xì)胞子集的時空動力學(xué)
CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在 TNBC 腫瘤中擴(kuò)展，對組合療法有反應(yīng)。為了破譯治療后的免疫細(xì)胞動力學(xué)，我們首先研究了不同T細(xì)胞子集上紫杉醇的調(diào)節(jié)。與非響應(yīng)者相比，響應(yīng)者顯示CD8-CXCL13、CD4-CXCL13和Tregs水平下降，同時在紫杉醇治療后CD8 Tem、Teff和CD4細(xì)胞水平升高（圖2B、2C和S2D）。有趣的是，CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在紫杉醇加阿特珠單抗治療后，在反應(yīng)靈敏的患者中都有所擴(kuò)大，導(dǎo)致他們在聯(lián)合治療組中所占的分?jǐn)?shù)高于治療后單獨(dú)的 paclitaxel治療（圖 2B、2C 和S2E）。同樣，我們的 Ti 分析也顯示了組合治療后 CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的擴(kuò)展，相比之下，在反應(yīng)靈敏的患者中，在 paclitaxel 治療后，它們的減少（圖 2D 和S2F）。這種觀察暗示了CXCL13 T細(xì)胞與PD-L1封鎖的相關(guān)性。我們進(jìn)一步利用TCR序列來追蹤對聯(lián)合療法有反應(yīng)的腫瘤中CXCL13 T細(xì)胞的血統(tǒng)起源，并發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)張既包含預(yù)先存在的克隆，也包含新滲透的克?。▓D2E和2F）
TNBC腫瘤中B細(xì)胞子集的特點和動態(tài)
我們觀察到CD19 B細(xì)胞與CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T細(xì)胞在TNBC腫瘤中與紫杉醇加阿特朱單抗（圖3A）的共定位。通過比較反應(yīng)性腫瘤和非反應(yīng)性腫瘤之間B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄差異，我們發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)性腫瘤中富含的B細(xì)胞，在抗原處理和表達(dá)途徑、干擾素（IFN）-γ反應(yīng)和T細(xì)胞活化等途徑中具有高度表達(dá)的基因。相比之下，富含非反應(yīng)性腫瘤的B細(xì)胞在B細(xì)胞活化、免疫球蛋白生成和幽默免疫反應(yīng)的通路中表現(xiàn)出高度表達(dá)的基因（圖3B和S3D）。
Bfoc 和 Lti 細(xì)胞在 TNBC 腫瘤中協(xié)同擴(kuò)張， 對組合療法有反應(yīng)。值得注意的是，Bn、Bmem 和 Bfoc 細(xì)胞主要富集于對紫杉醇和阿特朱單抗有反應(yīng)的腫瘤，而不是對紫杉醇有反應(yīng)的腫瘤（圖 3C 和S3G）。反應(yīng)者比兩個治療組的非反應(yīng)者（圖3C和S3G）的基線Bfoc水平要高得多，我們的Pi分析也顯示了Bfoc與有利的臨床反應(yīng)（圖3D）的關(guān)聯(lián)性。重要的是，我們描述了不同的B細(xì)胞子集的預(yù)后意義，并揭示Bfoc是最重要的B細(xì)胞亞型，與BRCA患者的有利臨床結(jié)果相關(guān)（圖3E：star方法） 。因此，Bfoc似乎是患者生存和ICB免疫治療中最重要的B細(xì)胞子集。
接下來，我們檢查了Bfoc與其他免疫細(xì)胞的連接。通過描述相關(guān)免疫細(xì)胞亞型，我們發(fā)現(xiàn)CD4-CXCL13和CD8-CXCL13在細(xì)胞比例上與Bfoc呈高相關(guān)性，特別是在治療后組（圖3F和S3J）。值得注意的是，ILC3-IL7R可以預(yù)測對這兩種治療方案（圖3J）的有利反應(yīng)，表明其在有效抗腫瘤免疫方面的潛在作用。
cDC1 在 TNBC 腫瘤中擴(kuò)展，對組合療法有反應(yīng)
mDC與TNBC腫瘤中的cDC1緊密相連，由于其轉(zhuǎn)錄相似性和細(xì)胞比例的相關(guān)動態(tài)變化（圖4C和4D）。對于使用紫杉醇加阿特珠單抗治療的患者，我們還觀察到，與 cDC1 和 pDC 的增加相比，治療后響應(yīng)者中的 mDC 減少，這可能是由于 paclitaxel 方案選擇性地減少了 mDC（圖 4B）。值得注意的是，mDC 和 cDC1 都展示了與 CD4-CXCL13（圖 4D 和S4H）協(xié)調(diào)的時間動力學(xué)，我們通過 TCGA BRCA 的批量 RNA-seq 數(shù)據(jù)（圖 4F）證實了它們的相關(guān)性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了多個配體受體對，包括 CD40LG-CD40，這些配體受體對可能會在 mDC、cDC1 和 CD4-CXCL13（圖 4G）之間進(jìn)行調(diào)停。有趣的是，CD8-CXCL13還表現(xiàn)出與mDC、cDC1和CD4-CXCL13的高度相關(guān)性，基于它們在細(xì)胞比例上的時間動態(tài)（圖4D和S4H）。這些觀察暗示CD4-CXCL13和CD8-CXCL13可能都由cDC1或mDC激活。
巨噬細(xì)胞子集與TNBC腫瘤中CXCL13 +T細(xì)胞的連接
以單細(xì)胞/巨噬細(xì)胞隔間為重點，我們發(fā)現(xiàn)，與組合治療組的響應(yīng)者相比，無反應(yīng)器表現(xiàn)出較高的巨噬細(xì)胞基線水平，在非響應(yīng)器中富含的巨噬細(xì)胞高度表達(dá)SPP1、TREM2、FN1和C3，而在響應(yīng)者中富含的巨噬細(xì)胞則高度表達(dá)CXCL9、MMP9和PLA2G2D （5A）。
我們還檢查了免疫細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)M+-CCL2和M+-MMP9也與CXCL13 T細(xì)胞（圖5E）高度相關(guān)。值得注意的是，這兩個宏噬菌體子集的基線水平較高，表明對組合療法（圖 5F）有良好的反應(yīng)。
組合治療后反應(yīng)性腫瘤中T細(xì)胞子集的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳動力學(xué)
轉(zhuǎn)錄本分析表明，IFNG、GZMK、GZMA和CD44的效應(yīng)基因和記憶相關(guān)基因： TBX21、BHLHE40和 BCL6 的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）： CD28和ICAS的共刺激分子，以及HLA基因和集成物被調(diào)高，而疲憊相關(guān)的基因，包括HAVCR2，LAYN，TIGIT和LAG3，在治療后在CD8-CXCL13中被降低（圖6A).CD8-CXCL13的表型變化也反映在其疲憊分?jǐn)?shù)的減少和效應(yīng)者記憶分?jǐn)?shù)的增加（圖6B）。CD8-CXCL13細(xì)胞的表觀遺傳特征，顯示T細(xì)胞衰竭標(biāo)記物（包括PDCD1、LAG3和CTLA4）的峰值特異性豐富，與CD8 Tex細(xì)胞的表觀遺傳特征一致（圖6c）。
我們通過比較組合治療前后的配對 scATAC-seq 數(shù)據(jù)，檢查了 CD8 Tem、CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的色度素可及性的全局動態(tài)。每個T細(xì)胞子集中微分OCR和相關(guān)基因的特征通報了CD8-CXCL13細(xì)胞的增強(qiáng)效應(yīng)和記憶特性，表明CD44、CXCR4、KLRG1、XCL2、CST7、ICOS和CD28的可及性增強(qiáng)，而治療后與衰竭相關(guān)的基因（如CREM和 MYO7A）的可及性降低（圖6D）。
TNBC腫瘤免疫細(xì)胞特征和動態(tài)摘要
我們調(diào)查了晚期TNBC患者免疫細(xì)胞的時間動態(tài)，或與阿特朱單抗的結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)了與患者反應(yīng)相關(guān)的免疫特征（圖7A-7C）。
A） 經(jīng)過不同治療的關(guān)鍵免疫細(xì)胞子集的特征和動態(tài)。紅色（或綠色）箭頭表示較高的基線水平，預(yù)測有利（或不利）反應(yīng)，或治療后反應(yīng)靈敏的患者免疫細(xì)胞子集的增加（或減少）。
（B） 反應(yīng)迅速和無反應(yīng)的腫瘤的免疫特征及其在不同治療方案下的動態(tài)。具有實質(zhì)性基線CXCL13+ T細(xì)胞、B細(xì)胞和促炎巨噬細(xì)胞的TNBC腫瘤，與具有大量免疫抑制巨噬細(xì)胞的TNBC腫瘤的耐藥性相比，對組合療法具有敏感性。紫杉醇療法減少，而阿特珠單抗增加反應(yīng)性腫瘤的關(guān)鍵抗腫瘤免疫細(xì)胞。
（C） CXCL13 +T細(xì)胞與其相關(guān)免疫細(xì)胞之間的潛在聯(lián)系，根據(jù)治療引起的時間動力學(xué)推斷。
總結(jié)
綜上，該研究揭示了TNBC患者對于anti-PD-L1免疫治療敏感和耐藥的分子機(jī)制，鑒定了關(guān)鍵免疫組分及其在免疫檢查點抑制劑和紫杉醇化療方案下的動態(tài)變化，闡明了紫杉醇化療與阿替利珠單抗聯(lián)合應(yīng)用不能有效增加TNBC患者治療效果的原因。該課題的研究結(jié)果對于當(dāng)前免疫治療聯(lián)合化療方案有重要指導(dǎo)意義，提示需要進(jìn)一步系統(tǒng)評估不同化療藥與免疫治療藥聯(lián)合使用的分子機(jī)制，才能有效提高聯(lián)合用藥方案對TNBC患者的治療效果。
