流程
實驗流程
用TRIzol，對總樣品的RNA進行分離和純化。然后用NanoDrop ND-1000對總RNA的量與純度進行質(zhì)控。再通過Bioanalyzer 2100對RNA的完整性進行檢測，同時通過瓊脂糖電泳的方案進行驗證。濃度>50ng/μL，RIN值>7.0，OD260/280>1.8，total RNA>1μg滿足下游實驗。加入鎂離子打斷試劑盒在94℃高溫條件下對total RNA進行片段化處理5min。使用免疫磁珠與m6A抗體預混，將預混好的m6A-免疫磁珠與片段化的RNA（含有核糖體RNA片段）進行IP，從而得到IP產(chǎn)物。IP產(chǎn)物在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一鏈cDNA，后加入接頭進行第一輪PCR--預變性94℃ 1min，98℃ 變性15s，55℃退火15s,68℃延伸30s,最后再保持68℃延伸2min，共5個循環(huán)，合成二鏈DNA。使用純化珠將擴增的DNA文庫進行純化。將R-Probes v2探針和ZapR v2 酶加入到DNA文庫從而達到去除核糖體RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA序列的目的--72℃ 孵育2min，4℃保持2min，37℃ 1h,72℃ 10min，最后4℃保持。通過第二輪PCR對最終文庫進行擴增，PCR程序設置與第一輪一致，循環(huán)數(shù)增加至12-16個。最后，我們使用illumina Novaseq? 6000 按照標準操作對其進行雙端測序，測序模式為PE150。
生物信息分析流程
下機原始數(shù)據(jù)格式為fastq，我們首先使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp）的默認參數(shù)對所有IP樣本和Input樣本下機原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，包括去除接頭、重復序列和低質(zhì)量序列，得到CleanData用于后續(xù)分析。然后使用HISAT2（http://daehwankimlab.github.io/hisat2）將CleanData比對到基因組上（拉丁文：Mus musculus, 基因組版本：v101），再利用得到的bam文件使用R包exomePeak2（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/exomePeak2.html）進行Peak calling和diff Peak分析，并使用ANNOVAR（ http://www.openbioinformatics.org/annovar/）對peak進行注釋。最后使用MEME2（http://meme-suite.org）和HOMER（http://homer.ucsd.edu/homer/motif）進行motif分析。基因組裝和定量軟件為StringTie（https://ccb.jhu.edu/software/stringtie），定量方式為FPKM（total exon fragments/mapped reads (millions)× exon length (kB)），并使用R包edgeR（https://bioconductor.org/packages/edgeR）進行差異分析，差異倍數(shù)FC（fold change）≥2或FC≤0.5且p值小于0.05。
MeRIP測序生信分析流程圖
Reference:
[1] Chen S.,et al. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.Bioinformatics, 34(17): i884–i890 (2018).
[2] Smith A.. Falco: high-speed FastQC emulation for quality control of sequencing data.F1000Research, 8: 1874 (2019).
[3] Wang L.,et al. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.Bioinformatics, 28(16): 2184-5 (2012).
[4] Kim D.,et al. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.Nature Methods, 12(4): 357–360 (2015).
[5] Meng J.,et al. A protocol for RNA methylation differential analysis with MeRIP-Seq data and exomePeak R/Bioconductor package.Methods, 69(3): 274-281 (2014).
[6] Bailey TL,et al. MEME Suite: tools for motif discovery and searching.Nucleic Acids Research, 37(Web Server issue:202-8): W202-8 (2009).
[7] Heinz S.,et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and b cell identities.Molecular Cell, 38(4): 576-89 (2010).
[8] Wang, K.,et al. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.Nucleic Acids Research, 38(16): e164 (2015).
[9] Pertea M.,et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads.Nature Biotechnology, 33(3): 290–5 (2015).
[10] Robinson MD,et al. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.Bioinformatics, 26(1): 139-40 (2010).
2020年陳建軍教授在Cancer Cell上發(fā)表的關于mRNA和non-coding RNA上m6A修飾的綜述值得一讀，聯(lián)川進行了全文翻譯：https://mp.weixin.qq.com/s/9lhlRAs425ePfclhfbvLqQ
