擬南芥T-DNA插入突變體拿到之后，我們需要先確定其插入位點(diǎn)相關(guān)信息。插入locus有時(shí)候未必是單一的，可能會(huì)插入一個(gè)基因的多個(gè)位置或者是插入多個(gè)基因，導(dǎo)致多基因突變。如果一開始沒有明確其插入的確切位置，那么勢必會(huì)導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題，難以把握你所得到的表型時(shí)候是因?yàn)槟康幕虻耐蛔儗?dǎo)致的還是其他基因突變導(dǎo)致的。那么問題就來了，如何確定突變體插入位點(diǎn)信息？下面就從TAIR（擬南芥種質(zhì)資源庫）網(wǎng)站介紹開始，說明一下突變體信息的確定方法。
1 TAIR網(wǎng)站
網(wǎng)址：https://www.arabidopsis.org/。網(wǎng)站首頁會(huì)有一些TAIR的介紹，封面圖片是經(jīng)常會(huì)變化，這一次的還是相當(dāng)?shù)闷恋?。最上面是?dǎo)航欄，有各種工具讓你使用?？梢匀タ纯?，了解一下都有哪些功能。今天使用的是搜索框，最最頂端的搜索框，可以查找你需要的基因，以及salk號(hào)查詢。
2 搜索seed stock
之前的名字就是seed stock，后面改成了germplasm(種質(zhì)資源)。通過這個(gè)入口，可以搜索相關(guān)Salk號(hào)的信息，這里隨便寫了一個(gè)salk號(hào)搜索一下。
3 詳細(xì)插入信息
這里可以看到該germplasm的T-DNA插入情況：單一插入還是多個(gè)位點(diǎn)插入；可能插入的位置（UTR, EXON OR INTRON）；具體插入的染色體位置；此外還有一個(gè)查看全基因組序列的連接，可以進(jìn)一步看到序列情況。
當(dāng)我們查看全基因組序列時(shí)，我們沒有看到我們自己的salk號(hào)的標(biāo)示，這個(gè)有點(diǎn)奇怪。我用藍(lán)色箭頭標(biāo)示出了網(wǎng)站提供的插入位點(diǎn)信息，很大可能在這個(gè)3'UTR的位置。
4 使用三引物法進(jìn)行驗(yàn)證
根據(jù)salk號(hào)進(jìn)行鑒定引物的設(shè)計(jì)，網(wǎng)站:T-DNA Primer Design，根據(jù)網(wǎng)站的說明，可以進(jìn)行純合株系及插入位點(diǎn)鑒定。
- 提交以后，會(huì)得到以下的信息，其中有pcr產(chǎn)物的長度，LP/RP兩個(gè)引物的序列，TM值， GC含量等信息。如果純合或者雜合，BP+RP產(chǎn)物（小于LP和RP擴(kuò)增出來的長度條帶）大小在600-900之間。然后你再將產(chǎn)物測序，比對(duì)到野生型序列，就可以看到完全比對(duì)上的位置和沒有比對(duì)上位置之間就是插入位置。
SALK_126458.33.60.x PRODUCT_SIZE 1167 PAIR_ANY_COMPL 0.00 PAIR_3'_COMPL 0.00 DIFF_TM 0.02 LP GAGGTGACAATGTTCTCCTCG Len 21 TM 59.71 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.02 3'_COMPL 0.00 RP GGTGAACGATCTTTGCAAGTC Len 21 TM 59.73 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.02 3'_COMPL 0.00 Insertion chr2 19152702 BP+RP_PRODUCT_SIZE 600-900
