https://www.nature.com/articles/s41586-024-08518-2
2025年2月27日德國馬普學(xué)會(huì)生物智能研究所等團(tuán)隊(duì)聯(lián)合攻關(guān)，發(fā)表在Nature主刊題為：Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology。研究背景是探討神經(jīng)元的基因表達(dá)譜與其形態(tài)和功能之間的關(guān)系：神經(jīng)元的形態(tài)、連接和功能等表型特征在很大程度上由不同基因的特定差異表達(dá)組合所決定；轉(zhuǎn)錄組空間中聚類的神經(jīng)元通常對(duì)應(yīng)不同的細(xì)胞類型，而且在秀麗隱桿線蟲神經(jīng)元和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等模型中，相同轉(zhuǎn)錄組類型的神經(jīng)元已被證明可以共享形態(tài)和功能。斑馬魚中腦視頂蓋由將視覺輸入轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)輸出的神經(jīng)元組成，其視拓?fù)溆成潆m然連續(xù)，但頂蓋的不同子區(qū)域在功能上具有專門化。為揭示頂蓋神經(jīng)元的細(xì)胞類型架構(gòu)，本研究對(duì)斑馬魚頂蓋神經(jīng)元進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定出60多種轉(zhuǎn)錄組定義的神經(jīng)元類型，這些細(xì)胞類型分布于特定的解剖層中。研究者通過雙光子鈣成像記錄了數(shù)以千計(jì)頂蓋神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的活動(dòng)，并將這些神經(jīng)元的功能響應(yīng)與各自的轉(zhuǎn)錄組特征相匹配；此外，利用特定轉(zhuǎn)基因品系對(duì)按照轉(zhuǎn)錄組類型鑒定的神經(jīng)元進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分析。結(jié)果顯示，即使屬于同一轉(zhuǎn)錄組類別的神經(jīng)元，其形態(tài)、神經(jīng)連接和視覺響應(yīng)也會(huì)因所在位置的不同而呈現(xiàn)顯著差異；將神經(jīng)元的空間坐標(biāo)納入分析后，在每一種轉(zhuǎn)錄組簇內(nèi)進(jìn)一步識(shí)別出在功能和形態(tài)上明顯不同的解剖學(xué)亞群。上述研究表明，外部的、與位置相關(guān)的因素拓展了基因表達(dá)相似神經(jīng)元的表型多樣性，意味著僅憑基因表達(dá)譜無法完全預(yù)測神經(jīng)元的功能和形態(tài)。
01
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背景介紹
神經(jīng)元的基因表達(dá)譜與其形態(tài)和功能之間存在密切聯(lián)系。 大量研究表明，神經(jīng)元的形態(tài)、連接方式以及功能等表型特征在很大程度上由特定的基因表達(dá)組合所決定。在轉(zhuǎn)錄組空間中聚類的神經(jīng)元往往對(duì)應(yīng)著不同的細(xì)胞類型，而且在某些情況下，這些通過轉(zhuǎn)錄組定義的類型在形態(tài)和功能上也表現(xiàn)出相應(yīng)的相似性?；诖烁拍?，神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域引入了“轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型”（transcriptomic type, 簡稱t-type）的分類方法，認(rèn)為每種神經(jīng)元類型獨(dú)特的基因表達(dá)模式?jīng)Q定了其發(fā)育軌跡，從而塑造出該細(xì)胞特有的形態(tài)（morphology, m-type）和功能（function, f-type）。模型生物的研究支持這種基因-表型對(duì)應(yīng)關(guān)系：例如，秀麗線蟲中118種解剖學(xué)上不同的神經(jīng)元類型各自表達(dá)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子組合，調(diào)控下游基因來決定神經(jīng)元的形態(tài)及其在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的功能；果蠅中，不同神經(jīng)元的差異基因表達(dá)譜與其特定的軸突或樹突連線模式相對(duì)應(yīng)。同樣，在小鼠視覺皮層中，屬于同一轉(zhuǎn)錄組類型的神經(jīng)元在形態(tài)和電生理性質(zhì)上表現(xiàn)出高度的一致性。這些發(fā)現(xiàn)共同闡明了神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組與其形態(tài)、功能之間的緊密聯(lián)系。?
然而，單憑轉(zhuǎn)錄組來定義細(xì)胞類型存在局限。 越來越多的證據(jù)表明，具有相似轉(zhuǎn)錄組特征的神經(jīng)元在形態(tài)和功能上可能表現(xiàn)出明顯的差異。傳統(tǒng)觀點(diǎn)假定轉(zhuǎn)錄組類型（t-type）、形態(tài)類型（m-type）和功能類型（f-type）三者是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，但事實(shí)上這種假設(shè)并不總是成立。神經(jīng)元的功能反應(yīng)以及樹突或軸突形態(tài)常受到外部調(diào)制因素和可塑性機(jī)制的影響，這意味著同一轉(zhuǎn)錄組類型內(nèi)部也可能存在顯著的異質(zhì)性。例如，在視覺皮層中，GABA能中間神經(jīng)元對(duì)刺激的選擇性調(diào)諧主要取決于動(dòng)物的行為狀態(tài)，而非其轉(zhuǎn)錄組類別。又如，小鼠大腦皮層中屬于同一轉(zhuǎn)錄組類型的神經(jīng)元在功能調(diào)諧特性上可能存在巨大差異，同時(shí)它們的形態(tài)連接模式也各不相同，表現(xiàn)為迥異的長程投射和局部回路。換言之，同一轉(zhuǎn)錄組定義的神經(jīng)元不一定在形態(tài)和生理響應(yīng)上完全一致。這些觀察揭示了僅依據(jù)轉(zhuǎn)錄組劃分細(xì)胞類型無法充分涵蓋神經(jīng)元的功能和形態(tài)多樣性。?
神經(jīng)元所處的空間定位及發(fā)育時(shí)序是影響其表型的重要外因。 鑒于基因表達(dá)譜不足以完全解釋神經(jīng)元表型的多樣性，研究者開始關(guān)注外在因素（如細(xì)胞的空間位置和發(fā)育階段）如何與轉(zhuǎn)錄組共同決定神經(jīng)元的形態(tài)和功能。已有觀點(diǎn)認(rèn)為，神經(jīng)元所在的解剖位置提供了一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控維度：不同區(qū)域的局部環(huán)境（例如可獲得的形態(tài)發(fā)生因子或突觸伙伴）可能對(duì)神經(jīng)元的最終表型產(chǎn)生影響。在斑馬魚視頂蓋（optic tectum, OT）中可以清楚地看到這種位置依賴效應(yīng)。斑馬魚OT沿前-后和背-腹軸接受來自視網(wǎng)膜的高度拓?fù)溆成漭斎耄纬闪伺c視覺空間對(duì)應(yīng)的連續(xù)視野地圖。在垂直于視頂蓋表面的淺-深軸上，OT具有明顯的分層結(jié)構(gòu)：淺層的神經(jīng)纖維層中，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突與視頂蓋神經(jīng)元的樹突形成突觸，而深層則是神經(jīng)元胞體所在的圍腦室層（SPV）。發(fā)育溯源研究顯示，新生的神經(jīng)元最初從近腦室區(qū)沿放射方向加入視頂蓋，隨后在發(fā)育晚期增添于視頂蓋的后緣；較早出生的神經(jīng)元會(huì)在成熟過程中逐漸被推移到表層的SPV層，并將神經(jīng)突伸入淺層的神經(jīng)纖維層。與此同時(shí)，諸如形態(tài)發(fā)生素、軸突導(dǎo)向因子和細(xì)胞表面分子等外在信號(hào)在發(fā)育進(jìn)程中沿視頂蓋三個(gè)軸向的濃度分布并不均一。這些證據(jù)表明，神經(jīng)元在不同時(shí)空位置所經(jīng)歷的獨(dú)特環(huán)境線索會(huì)影響其形態(tài)和功能表型，從而使基因表達(dá)相似的神經(jīng)元表現(xiàn)出位置依賴的多樣性。近年來的研究確實(shí)證實(shí)了這一點(diǎn)：外源的、位置依賴的因素能夠拓展遺傳背景相似神經(jīng)元的表型范圍，導(dǎo)致同一轉(zhuǎn)錄組類型的細(xì)胞在形態(tài)和功能上出現(xiàn)顯著差異。
?斑馬魚視頂蓋因此成為研究視覺處理與空間拓?fù)潢P(guān)系的理想模型系統(tǒng)。 斑馬魚OT是魚類中腦頂蓋的重要視覺處理中心，具有明確的層狀組織結(jié)構(gòu)和精細(xì)的視野拓?fù)溆成?。雖然視頂蓋上的視野地圖是連續(xù)的，但其中不同子區(qū)域已被發(fā)現(xiàn)具有特定的功能分工。這種結(jié)構(gòu)特征使其非常適合探究神經(jīng)元功能與空間位置的對(duì)應(yīng)關(guān)系。尤其值得注意的是，斑馬魚幼體的大腦透明且視頂蓋體積小，神經(jīng)元數(shù)量適中，這為高分辨率地記錄和分析整個(gè)視頂蓋內(nèi)神經(jīng)元群提供了便利。研究者可以借助雙光子鈣成像等技術(shù)同時(shí)測量數(shù)千個(gè)視頂蓋神經(jīng)元對(duì)視覺刺激的反應(yīng)，并結(jié)合多重原位雜交等方法確定這些神經(jīng)元的分子表達(dá)特征。通過在單細(xì)胞水平關(guān)聯(lián)每個(gè)神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組類型、形態(tài)特征、功能響應(yīng)與其空間位置，斑馬魚視頂蓋為理解基因表達(dá)譜與神經(jīng)元表型和拓?fù)湮恢弥g的關(guān)系提供了獨(dú)特且強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
02
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科學(xué)問題與創(chuàng)新性
1.神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組與表型關(guān)系的復(fù)雜性：盡管已有研究表明神經(jīng)元的基因表達(dá)譜（轉(zhuǎn)錄組）與其功能和形態(tài)密切相關(guān)，但具體到特定腦區(qū)（如斑馬魚視頂蓋），轉(zhuǎn)錄組定義的細(xì)胞類型在空間分布上如何與功能和形態(tài)表型相對(duì)應(yīng)仍然不明確。本研究系統(tǒng)闡述了斑馬魚視頂蓋神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組類型在空間維度上的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，以及這一結(jié)構(gòu)與神經(jīng)元功能響應(yīng)和形態(tài)特征之間的關(guān)聯(lián)性。
2.神經(jīng)元表型空間分布的精細(xì)解析：盡管傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)已實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元類型的粗略分類，但在具體腦區(qū)內(nèi)，同一轉(zhuǎn)錄組類型神經(jīng)元在不同空間位置的功能和形態(tài)差異仍未清晰解析。研究利用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）結(jié)合高分辨率空間標(biāo)記技術(shù)，明確了斑馬魚視頂蓋超過60種轉(zhuǎn)錄組定義的細(xì)胞類型在解剖層面的分布，并進(jìn)一步揭示了不同空間定位的神經(jīng)元在功能和形態(tài)上的差異。
3.功能成像與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的創(chuàng)新性整合分析：研究創(chuàng)新性地結(jié)合了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）和在體雙光子鈣成像技術(shù)，首次在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)元功能響應(yīng)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)匹配。這一方法的突破在于，它提供了一種在單細(xì)胞分辨率下同時(shí)解讀轉(zhuǎn)錄組信息和實(shí)時(shí)功能響應(yīng)的新途徑，顯著提升了對(duì)神經(jīng)元功能異質(zhì)性的理解。
4.形態(tài)與功能的拓?fù)浞植家?guī)律：研究通過在特定轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的斑馬魚品系中進(jìn)行稀疏標(biāo)記和三維形態(tài)重建，揭示了轉(zhuǎn)錄組相似的神經(jīng)元在視頂蓋不同空間區(qū)域呈現(xiàn)截然不同的形態(tài)與投射模式。這種空間依賴性的表型差異性為神經(jīng)元分類標(biāo)準(zhǔn)的拓展提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
5.空間位置和發(fā)育因素在神經(jīng)元多樣性中的作用：本研究強(qiáng)調(diào)了空間位置和發(fā)育時(shí)序?qū)τ谏窠?jīng)元形態(tài)和功能多樣性的調(diào)控作用，揭示了相同轉(zhuǎn)錄組類型神經(jīng)元的空間位置依賴性表型多樣化現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)以轉(zhuǎn)錄組為唯一標(biāo)準(zhǔn)定義神經(jīng)元類型的觀點(diǎn)，提出了更為全面的神經(jīng)元分類框架。
6.斑馬魚視頂蓋作為視覺拓?fù)溲芯康哪Ｐ蛣?chuàng)新：研究充分利用了斑馬魚視頂蓋具有明確的分層結(jié)構(gòu)、高空間分辨率以及連續(xù)視野拓?fù)溆成涞奶烊粌?yōu)勢，成功建立了視頂蓋神經(jīng)元的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜和功能-形態(tài)關(guān)系。這不僅豐富了斑馬魚作為神經(jīng)科學(xué)研究的模型系統(tǒng)的應(yīng)用，也為后續(xù)視覺處理機(jī)制和神經(jīng)元分類標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)范式。
03
?視頂蓋的細(xì)胞類型具有分子多樣性
為了全面描述斑馬魚視頂蓋（OT）的轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型（t-type）組成，我們對(duì)發(fā)育后6至7天（6–7 dpf）的斑馬魚幼體視頂蓋進(jìn)行了基于液滴的單細(xì)胞RNA測序（droplet-based single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。我們共測序了45,766個(gè)細(xì)胞，這相當(dāng)于對(duì)單個(gè)視頂蓋半球中細(xì)胞數(shù)量（約6,000個(gè)神經(jīng)元）的7倍以上的覆蓋率。這些細(xì)胞根據(jù)其轉(zhuǎn)錄組特征被聚類為25個(gè)主要細(xì)胞簇（如圖1a）?；诓町惐磉_(dá)的簇特異性基因，我們鑒定出3個(gè)祖細(xì)胞簇、1個(gè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞簇、14個(gè)神經(jīng)元簇，以及另外6個(gè)非神經(jīng)元細(xì)胞簇。
隨后，我們將處于有絲分裂后階段的神經(jīng)元（表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記基因elavl3的36,825個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行再次聚類（圖1b）。去除注釋不明確的細(xì)胞簇后，剩余的細(xì)胞簇被明確區(qū)分為興奮性神經(jīng)元（gad1b?, slc17a6a+和slc17a6b+）和抑制性神經(jīng)元（gad1b+, slc17a6a?和slc17a6b?）（圖2c,d）。最終鑒定出33個(gè)興奮性轉(zhuǎn)錄組類型（t-types，簇編號(hào)為e1至e33，共15,866個(gè)細(xì)胞）和33個(gè)抑制性轉(zhuǎn)錄組類型（簇編號(hào)為i1至i33，共10,901個(gè)細(xì)胞）。其中20個(gè)神經(jīng)元類型可用特異的差異表達(dá)基因作為單獨(dú)的互斥性標(biāo)記，而其余類型則需要多個(gè)稀疏表達(dá)基因的組合來明確定義（圖1e,f）?？傮w而言，我們在斑馬魚幼體視頂蓋中共識(shí)別出66個(gè)神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組類型。值得一提的是，我們所鑒定的細(xì)胞類型和標(biāo)記基因組合與近期一項(xiàng)斑馬魚視頂蓋的研究有所不同：該研究在scRNA-seq前，首先使用特定增強(qiáng)子捕獲品系進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選（FACS），這導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏向于被該品系標(biāo)記的細(xì)胞群體，很可能未完整覆蓋全部視頂蓋細(xì)胞類型，并觀察到更多不成熟神經(jīng)元的比例。相比之下，我們的方法旨在囊括視頂蓋所有細(xì)胞，因此能夠更全面地揭示神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞群的豐富多樣性。
04
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轉(zhuǎn)錄組類型在視頂蓋中具有空間拓?fù)浞植?/p>
為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組類型（t-types）是否相對(duì)于視頂蓋（OT）的空間三軸具有特定分布規(guī)律，我們選取了僅在單一或少數(shù)幾個(gè)簇中表達(dá)的差異基因（圖1），并通過多重RNA原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（hybridization chain reaction, HCR）分析了它們的空間表達(dá)模式。我們將HCR表達(dá)模式對(duì)齊到標(biāo)準(zhǔn)的斑馬魚腦圖譜（mapzebrain atlas，https://mapzebrain.org）中，測量了其在相同橫斷面和冠狀面中的表達(dá)水平（圖2）。
我們發(fā)現(xiàn)，這些基因定義的神經(jīng)元類型在視頂蓋淺-深（superficial-to-deep, SD）軸的特定區(qū)域顯著富集。特別是，抑制性（GABAergic）神經(jīng)元主要富集于圍腦室層（stratum periventriculare, SPV）深部，而興奮性（谷氨酸能，glutamatergic）神經(jīng)元主要位于SPV淺表層，而膽堿能神經(jīng)元?jiǎng)t夾在二者之間。雖然大多數(shù)興奮性和抑制性t-types總體上遵循這一分布規(guī)則，但也存在例外。例如，興奮性標(biāo)記基因bhlhe23在SPV深層神經(jīng)元中表達(dá)，并被抑制性神經(jīng)元標(biāo)記（如insm2、chodl、npb和npy）所包圍（圖2）。而興奮性標(biāo)記基因ccka、onecut1、pitx2和zic2a僅限于淺層SPV的神經(jīng)元表達(dá)（圖2），cort、cckb和irx1b則表達(dá)于SPV中間層的神經(jīng)元中（圖2）。某些t-types如atf5b和sp5l則遍布SPV各個(gè)區(qū)域；抑制性標(biāo)記基因esrrb和rpp25b呈現(xiàn)雙層表達(dá)模式（圖2）。相同標(biāo)記基因的神經(jīng)元彼此之間極少直接相鄰（圖2），提示同類神經(jīng)元在SPV中呈鑲嵌分布，類似視網(wǎng)膜中個(gè)別類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）的排列方式。
為了獲得視頂蓋細(xì)胞類型結(jié)構(gòu)的整體圖像，我們手動(dòng)標(biāo)注了各神經(jīng)元的質(zhì)心位置（圖2c,d），并測量每個(gè)t-type內(nèi)神經(jīng)元質(zhì)心到其他所有t-type神經(jīng)元最近鄰的三維空間距離（nearest neighbour distances, NND）。然后，對(duì)每個(gè)t-type的平均NND矢量進(jìn)行層次聚類（hierarchical clustering，圖2e）。聚類的NND矢量揭示SPV明確分成三個(gè)解剖學(xué)層次：淺層、中間層和深層（圖2e,f）。打亂標(biāo)簽的對(duì)照中，這種組織結(jié)構(gòu)則消失。鑒于SPV淺表細(xì)胞比深層細(xì)胞更早出生，這一結(jié)果表明，類似視網(wǎng)膜發(fā)育，細(xì)胞類別和類型以預(yù)定順序發(fā)育，興奮性類型通常早于抑制性類型（圖2）。
為了將外側(cè)韁核中的snRNA-seq定義的細(xì)胞類型與島葉、殼核和杏仁核中的細(xì)胞類型進(jìn)行比較（圖2A），我們對(duì)獼猴杏仁核（44,967個(gè)細(xì)胞）、島葉（76,527個(gè)細(xì)胞）和殼核（39,439個(gè)細(xì)胞）中的細(xì)胞進(jìn)行了UMAP聚類分析，并使用已知的標(biāo)記基因?qū)垲愡M(jìn)行注釋。為了保證一致性，我們使用了來自相同兩只獼猴供體的細(xì)胞，并將每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)下采樣至大約15,000個(gè)細(xì)胞。對(duì)合并細(xì)胞的集成聚類分析顯示，大多數(shù)聚類包括來自所有四個(gè)區(qū)域的細(xì)胞，盡管各區(qū)域的相對(duì)貢獻(xiàn)不同?？傮w來看，外側(cè)韁核的聚類與島葉的聚類更為相似，而與殼核或杏仁核的聚類差異較大（圖2B）。
05
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組合基因表達(dá)模式進(jìn)一步明確了細(xì)胞類型在空間軸上的分布
空間分析所選的差異表達(dá)基因包括僅在單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞簇中表達(dá)的標(biāo)記基因。為了進(jìn)一步探討由標(biāo)記基因組合定義的轉(zhuǎn)錄亞型在空間上的組織結(jié)構(gòu)，我們針對(duì)分別表達(dá)atf5b和sp5l基因的細(xì)胞進(jìn)行了迭代多重HCR標(biāo)記，并考察它們的空間定位關(guān)系。我們重點(diǎn)關(guān)注轉(zhuǎn)錄因子和其他獨(dú)特效應(yīng)基因（主要編碼神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)合成或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的組合表達(dá)模式?；騛tf5b在簇e17中表達(dá)強(qiáng)烈，而在其他幾個(gè)簇（如e6、e14、e21）中表達(dá)較弱（圖1和圖3）?；诖豦17的標(biāo)記，我們深入探索了atf5b相關(guān)細(xì)胞類型的解剖排列。共表達(dá)atf5b和轉(zhuǎn)錄因子foxb1a或etv1的神經(jīng)元在淺-深軸上呈現(xiàn)明顯分隔，與已知的分子層類似；而與抑制細(xì)胞增殖的基因cebpa共表達(dá)的神經(jīng)元?jiǎng)t在淺表后區(qū)表現(xiàn)出較高密度（圖3a,b）。類似地，共表達(dá)sp5l與效應(yīng)基因uts1和chata的神經(jīng)元分布在中間分子層，而與神經(jīng)發(fā)生因子neurod1共表達(dá)的細(xì)胞則集中于后區(qū)（圖3d,e）?？傮w上，無論由單個(gè)標(biāo)記基因還是基因組合定義的細(xì)胞簇，都在淺-深軸方向上明顯分層，而其在前-后軸（SPV）的分布則與神經(jīng)發(fā)生因子及神經(jīng)元自后緣增殖區(qū)向前緣分化的進(jìn)程密切相關(guān)。
06
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同一細(xì)胞類型內(nèi)神經(jīng)元的視覺響應(yīng)存在差異
接下來，我們檢驗(yàn)了給定t-type內(nèi)神經(jīng)元是否具有一致的感覺或運(yùn)動(dòng)特征偏好。為此，我們利用轉(zhuǎn)基因幼魚（elavl3:H2B-GCaMP6s）進(jìn)行了二維體積雙光子鈣成像，記錄了視頂蓋神經(jīng)元對(duì)一系列行為相關(guān)視覺刺激的鈣活動(dòng)。這些刺激包括局部或整體運(yùn)動(dòng)線索：不同方向的運(yùn)動(dòng)點(diǎn)（連續(xù)或跳躍式運(yùn)動(dòng)，模擬中性、捕食或社交線索）、前向運(yùn)動(dòng)的光柵（觸發(fā)視覺運(yùn)動(dòng)反應(yīng)）、逐漸逼近的黑色圓盤（模擬捕食者或碰撞物）及環(huán)境亮度變化（圖4a）。為了確定記錄神經(jīng)元的t-type，我們隨后利用迭代多重HCR對(duì)最多六個(gè)互斥的標(biāo)記基因進(jìn)行標(biāo)記（pitx2和ccka）。通過空間配準(zhǔn)兩個(gè)數(shù)據(jù)集，我們成功地為來自6條魚的1,304個(gè)功能明確的神經(jīng)元分配了特定的t-type（圖4b及方法部分）。
我們發(fā)現(xiàn)每種t-type的神經(jīng)元平均響應(yīng)至少對(duì)兩種刺激明顯高于群體平均水平（圖4c）。例如，運(yùn)動(dòng)的點(diǎn)和光柵對(duì)atf5b類型的神經(jīng)元激發(fā)最強(qiáng)，而逼近刺激和OFF信號(hào)則在itpr1b類型神經(jīng)元中表現(xiàn)最明顯（圖4c）。為了測試同一或不同t-type的神經(jīng)元之間功能響應(yīng)的相似性，我們計(jì)算了跨個(gè)體所有t-type神經(jīng)元鈣響應(yīng)的相關(guān)性矩陣（圖4d）。排序后的相關(guān)性矩陣顯示，每個(gè)t-type內(nèi)部及不同t-type之間存在明顯的正負(fù)相關(guān)簇，表明每種t-type內(nèi)部功能響應(yīng)存在顯著多樣性，主要差異在于局部運(yùn)動(dòng)或整體運(yùn)動(dòng)偏好神經(jīng)元的比例（圖4d）。共表達(dá)pitx2和ccka的神經(jīng)元（僅12個(gè)細(xì)胞）也表現(xiàn)出對(duì)局部和整體運(yùn)動(dòng)的混合反應(yīng)，與單個(gè)標(biāo)記基因定義的神經(jīng)元類似。6個(gè)被檢測的標(biāo)記基因中，神經(jīng)元之間的鈣響應(yīng)相關(guān)性在同一t-type內(nèi)明顯高于不同t-type之間（圖4e）。我們因此得出結(jié)論，同一t-type神經(jīng)元的視覺調(diào)諧并非完全一致，但整體上仍比其他類型更為相似。這一發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物上丘（OT的同源結(jié)構(gòu)）的研究結(jié)果一致。
07
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轉(zhuǎn)錄組與空間位置共同決定神經(jīng)元功能
接下來，我們研究了視頂蓋中的功能響應(yīng)類型（f-type）是否與特定的t-type相關(guān)聯(lián)。為此，我們首先對(duì)未經(jīng)過HCR標(biāo)記但功能反應(yīng)強(qiáng)烈的7,094個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行聚類分析，確定了17種明確的f-type（圖5a）。這些f-type在UMAP降維空間中形成了五個(gè)主要簇，分別對(duì)應(yīng)于局部運(yùn)動(dòng)、ON響應(yīng)、OFF響應(yīng)、逼近刺激和運(yùn)動(dòng)光柵響應(yīng)的神經(jīng)元類別（圖5b,c）。然后我們將每個(gè)經(jīng)過HCR標(biāo)記的功能記錄區(qū)域（ROI）分配到這17種f-type之一，發(fā)現(xiàn)沒有任何一種f-type僅限于某個(gè)特定t-type內(nèi)高比例存在。另一方面，將HCR標(biāo)記的功能ROI映射至UMAP空間則顯示某些特定的t-type在功能超簇內(nèi)局部富集（圖5e）。
我們推測，同一t-type內(nèi)部f-type的多樣性可能起源于神經(jīng)元細(xì)胞體位置的解剖學(xué)差異。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將記錄到的同一t-type內(nèi)相同f-type的神經(jīng)元組合為t/f簇，并分析其解剖分布。發(fā)現(xiàn)t/f簇通常沿前-后軸明顯分離，例如f-type 4和9在**itpr1b+**神經(jīng)元中幾乎沒有空間重疊（圖5f）。通過核密度估計(jì)（KDE）測量t/f簇在空間上的重疊程度，我們確認(rèn)真實(shí)數(shù)據(jù)的空間分離程度顯著高于隨機(jī)對(duì)照組（圖5g）。由此證明視頂蓋t-type內(nèi)細(xì)胞體位置明顯影響其功能表型。
08
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轉(zhuǎn)錄組與空間位置共同決定神經(jīng)元形態(tài)
視頂蓋（OT）神經(jīng)元具有極其豐富的形態(tài)多樣性，包括特定的樹突分支及軸突投射靶區(qū)。為了探索轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型（t-types）是否與不同的神經(jīng)元形態(tài)類型相關(guān)，我們在表達(dá)atf5b、cort、itpr1b 和 sp5l 基因的轉(zhuǎn)基因報(bào)告品系中，以稀疏標(biāo)記的方法對(duì)單個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記，并追蹤其具體形態(tài)。結(jié)果顯示，絕大多數(shù)表達(dá)cort的神經(jīng)元是抑制性圍腦室中間神經(jīng)元（periventricular interneurons, PVINs），它們的細(xì)胞體位于圍腦室層（stratum periventriculare, SPV）內(nèi)。這些表達(dá)cort的中間神經(jīng)元在樹突分層模式上存在明顯差異：其中兩種類型的神經(jīng)元單層分布于淺層灰質(zhì)和纖維層（stratum griseum et fibrosum superficiale, SFGS），分別表現(xiàn)為較窄（PVIN 1a）和較寬（PVIN 1b）的分層結(jié)構(gòu)；第三種類型則為雙層分布，在中央灰質(zhì)層與白質(zhì)層（SGC/SAC）及SFGS兩個(gè)不同層次內(nèi)都有樹突分布（PVIN 2）。此外，我們還觀察到一種表達(dá)cort的神經(jīng)元將軸突投射到背側(cè)丘腦（dorsal thalamus）（圖6a。表達(dá)itpr1b的神經(jīng)元的細(xì)胞體則完全位于神經(jīng)纖維層（neuropil）內(nèi)（圖6b）。這些神經(jīng)元的突起通常表現(xiàn)出三層分布的形態(tài)結(jié)構(gòu)，與成年鯉科魚類中報(bào)道的視頂蓋錐體型/Ⅰ型神經(jīng)元（tectal pyramidal/type I neurons）十分相似，但在這一轉(zhuǎn)基因品系中，我們也觀察到了單層和雙層分布的其他形態(tài)類型。
興奮性轉(zhuǎn)錄組類型atf5b 和 sp5l 包含了特定的亞群，這些亞群分別表現(xiàn)為同側(cè)或?qū)?cè)投射的神經(jīng)元以及樹突分布多樣的中間神經(jīng)元（圖6c,d）?？傮w上，我們發(fā)現(xiàn)，在同一轉(zhuǎn)基因品系中觀察到的單個(gè)神經(jīng)元的投射模式及樹突分布類型數(shù)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了根據(jù)該標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄組聚類所預(yù)期的類型數(shù)量。這一規(guī)律不僅適用于我們研究的單個(gè)聚類標(biāo)記基因（如cort、itpr1b），也適用于表達(dá)于多個(gè)轉(zhuǎn)錄簇中的基因（如atf5b、sp5l）。
我們進(jìn)一步探討是否能夠依據(jù)轉(zhuǎn)錄組類型更細(xì)致地區(qū)分具有類似投射模式的神經(jīng)元。對(duì)表達(dá)atf5b和sp5l神經(jīng)元的共聚焦圖像進(jìn)行空間配準(zhǔn)后，清楚地顯示出二者在目標(biāo)腦區(qū)中的差異（圖6g,h）：表達(dá)sp5l的神經(jīng)元在蓋區(qū)的峽核（nucleus isthmi，一個(gè)被證明為GABA能的腦區(qū)）同側(cè)投射形成軸突側(cè)支，而表達(dá)atf5b的神經(jīng)元?jiǎng)t在峽核的谷氨酸能區(qū)域形成了同側(cè)軸突側(cè)支投射（圖6h）。與t/f簇（轉(zhuǎn)錄類型與功能類型共同定義的細(xì)胞簇）類似，同一t-type的神經(jīng)元形態(tài)在視頂蓋內(nèi)表現(xiàn)出明顯的位置差異性：例如atf5b和sp5l神經(jīng)元在視頂蓋前部區(qū)域通常表現(xiàn)為中間神經(jīng)元，而在視頂蓋后部區(qū)域則多表現(xiàn)為長距離投射神經(jīng)元（圖6e,f）。綜合以上發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為每種轉(zhuǎn)錄組定義的神經(jīng)元類型（t-type）包含了一系列特定的形態(tài)和連接模式，這些模式在視頂蓋的前-后軸方向上呈現(xiàn)明確的位置依賴性分布特征。
09
?技術(shù)路線
1.單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）：
對(duì)6–7日齡斑馬魚幼體的視頂蓋進(jìn)行大規(guī)模懸滴式單細(xì)胞RNA測序，鑒定出66種不同的神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組類型，包括興奮性和抑制性神經(jīng)元亞群及其特異分子標(biāo)記。
2.空間轉(zhuǎn)錄組分析（HCR 原位雜交）：
在完整視頂蓋組織中應(yīng)用多重RNA原位雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）技術(shù)標(biāo)記關(guān)鍵類型特異基因，并將其信號(hào)配準(zhǔn)到標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜，以繪制各轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型沿視頂蓋三維軸線的空間分布。
3.雙光子鈣成像：
利用雙光子顯微鏡對(duì)活體斑馬魚進(jìn)行全腦容積成像，記錄數(shù)千個(gè)視頂蓋神經(jīng)元對(duì)一系列視覺刺激的鈣信號(hào)響應(yīng)，刺激包括局部運(yùn)動(dòng)（運(yùn)動(dòng)點(diǎn)光標(biāo)）、整體運(yùn)動(dòng)（運(yùn)動(dòng)光柵）、漸增/漸減光強(qiáng)和擴(kuò)張逼近等行為相關(guān)視覺線索。
4.成像后 HCR 配準(zhǔn)：
在功能成像實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)同一只實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行多輪 HCR 探針染色，檢測多達(dá)6種互斥表達(dá)的標(biāo)記基因，隨后將鈣成像獲得的每個(gè)神經(jīng)元ROI與其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型進(jìn)行匹配。通過成像數(shù)據(jù)與分子標(biāo)記的配準(zhǔn)，關(guān)聯(lián)每個(gè)記錄神經(jīng)元的功能反應(yīng)與其轉(zhuǎn)錄組身份。
5.轉(zhuǎn)基因標(biāo)記與稀疏形態(tài)追蹤：
構(gòu)建或選用驅(qū)動(dòng)特定 marker 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，選擇目標(biāo)轉(zhuǎn)錄組類型神經(jīng)元采用稀疏示蹤策略（隨機(jī)低密度標(biāo)記單細(xì)胞），并對(duì)單個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行三維形態(tài)重構(gòu).該方法刻畫了不同轉(zhuǎn)錄組類型在不同位置的樹突和軸突形態(tài)特征，為功能類型與形態(tài)多樣性的耦合分析提供支撐。
10
?文章每個(gè)結(jié)果總結(jié)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果揭示了斑馬魚視頂蓋神經(jīng)元的高度多樣性：共鑒定出66種轉(zhuǎn)錄組類型（t-types），涵蓋33種興奮性和33種抑制性神經(jīng)元。每一種t-type均由特定的差異基因表達(dá)譜定義，一部分類型有獨(dú)特的單基因標(biāo)記，其余則可通過稀疏的標(biāo)記基因組合明確辨識(shí)。這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)定義的細(xì)胞類型在組織中并非隨機(jī)分布，而是顯示出分層的解剖排列：基于最近鄰距離聚類分析，可將視頂蓋室周帶（SPV）中的細(xì)胞類型歸為淺、中、深三個(gè)分子層。具體而言，最表層主要由谷氨酸能興奮性神經(jīng)元構(gòu)成，最深層富含GABA能抑制性神經(jīng)元，中間層則夾有膽堿能神經(jīng)元。相同類型細(xì)胞在SPV中通常呈馬賽克分布而很少緊鄰聚集，體現(xiàn)出細(xì)胞類型在微觀拓?fù)渖系木鶆蜩偳短卣鳌?
進(jìn)一步的空間轉(zhuǎn)錄組分析表明，轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型沿視頂蓋主要軸線呈現(xiàn)拓?fù)涠ㄎ弧Ｑ芯窟x取多種只在單一或少數(shù)簇中表達(dá)的類型標(biāo)記基因，利用多重HCR原位雜交測定了它們在視頂蓋三維坐標(biāo)中的分布。結(jié)果顯示，不同t-type的細(xì)胞體在背-腹（淺-深）軸上富集于特定解剖層面，而在前-后軸上也存在系統(tǒng)性梯度。尤其是結(jié)合多個(gè)標(biāo)記的共表達(dá)模式可以將轉(zhuǎn)錄組簇細(xì)分為位置不同的亞群：例如，在 atf5b 表達(dá)的神經(jīng)元中，共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 foxb1a 或 etv1 的亞群定位于SPV的不同深度層，而共表達(dá) cebpa 的亞群則主要分布于SPV表層的后部區(qū)域；同樣地，sp5l 陽性的神經(jīng)元中，與 uts1 或膽堿能合成酶 chata 共表達(dá)的細(xì)胞局限于中間層，而與神經(jīng)發(fā)生因子 neurod1 共表達(dá)的細(xì)胞則集中于后區(qū)。整體而言，由單一標(biāo)記或組合標(biāo)記界定的細(xì)胞群在背-腹軸上均表現(xiàn)出空間分離，而在前-后軸上的分布差異則與神經(jīng)發(fā)生時(shí)序和后端邊緣的新生區(qū)有關(guān)。這表明將轉(zhuǎn)錄組身份與空間坐標(biāo)相結(jié)合，可以進(jìn)一步細(xì)分細(xì)胞類型——基因表達(dá)極其相似的神經(jīng)元在解剖位置上形成局部聚類，豐富了細(xì)胞類型的精細(xì)劃分。
在功能層面，同一轉(zhuǎn)錄組類型的神經(jīng)元在視覺反應(yīng)選擇性上出現(xiàn)分化。通過雙光子鈣成像記錄大量神經(jīng)元對(duì)多種視覺刺激的響應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)屬于同一 t-type 的細(xì)胞對(duì)刺激的調(diào)諧并不完全相同：每一種轉(zhuǎn)錄組類型內(nèi)部都包含功能響應(yīng)各異的子集。對(duì)鈣信號(hào)響應(yīng)模式進(jìn)行無偏聚類，定義出17種功能類型（f-types），這些f-type可歸并為對(duì)不同視覺特征敏感的五個(gè)類別，包括偏好局部運(yùn)動(dòng)、整體運(yùn)動(dòng)（光柵）、亮度增加（ON）或降低（OFF）、以及逼近looming刺激的群組。然而，功能類別與轉(zhuǎn)錄組類別并非一一對(duì)應(yīng)：在將每個(gè)記錄神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組身份與其功能歸類相比較后發(fā)現(xiàn)，沒有任何一種功能類型是某單一t-type獨(dú)有或高度富集的，同時(shí)也沒有任一轉(zhuǎn)錄組類型只對(duì)應(yīng)單一功能反應(yīng)。換言之，同源的轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型內(nèi)部包含多種功能調(diào)諧的神經(jīng)元，而具有相似功能響應(yīng)的神經(jīng)元可以來源于不同的轉(zhuǎn)錄組類型。盡管如此，統(tǒng)計(jì)分析顯示同一 t-type 內(nèi)部的神經(jīng)元在功能上仍比不同 t-type 之間更為相似，但這種相似性更多體現(xiàn)在局部 vs 全局運(yùn)動(dòng)偏好細(xì)胞比例上的差異，而非整個(gè)類型功能的統(tǒng)一。上述結(jié)果證實(shí)，即使在視頂蓋這樣具有視拓?fù)溆成涞哪X區(qū)，轉(zhuǎn)錄組定義的類型與功能表型之間存在顯著的多對(duì)多關(guān)系。
為解析轉(zhuǎn)錄組類型、空間位置和功能三者的關(guān)聯(lián)，作者進(jìn)一步比較了解剖位置與功能特征對(duì)細(xì)胞類型的預(yù)測作用。支持向量機(jī)分類分析顯示，單憑神經(jīng)元的解剖坐標(biāo)就能比其功能響應(yīng)模式更準(zhǔn)確地預(yù)測其轉(zhuǎn)錄組類型歸屬。同時(shí)，將細(xì)胞空間位置與功能信息相結(jié)合并未顯著提高預(yù)測準(zhǔn)確率，這意味著空間位置本身已包含決定細(xì)胞類型的重要信息。功能分類分析也顯示，每種轉(zhuǎn)錄組類型的神經(jīng)元在功能空間中往往散布于多個(gè)簇，但特定轉(zhuǎn)錄組類型傾向于在某些功能“超簇”中局部富集，例如含 atf5b 基因的細(xì)胞更多地出現(xiàn)在偏好局部運(yùn)動(dòng)的功能簇附近。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了視頂蓋內(nèi)存在基于解剖區(qū)域的功能特化：不同區(qū)域（如前 versus 后、淺 versus 深）的局部回路輸入/輸出差異，可能誘導(dǎo)了相同基因類型神經(jīng)元在功能上的不同調(diào)整。換言之，細(xì)胞的組織位置是拓展其表型的重要外因，使得基因上相似的神經(jīng)元在不同區(qū)域承擔(dān)不同功能角色。
最后，研究在形態(tài)層面證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組類型內(nèi)部的形態(tài)多樣性與位置密切相關(guān)。通過在多條轉(zhuǎn)基因品系中稀疏標(biāo)記單個(gè)神經(jīng)元并重建形態(tài)，作者比較了若干轉(zhuǎn)錄組類型在不同位置的神經(jīng)元形態(tài)差異。例如，對(duì)于 atf5b 型和 sp5l 型神經(jīng)元，在視頂蓋前部的位置往往發(fā)育為局部投射范圍受限的中間神經(jīng)元，而在后部的位置則傾向于發(fā)育為長程投射神經(jīng)元。同一轉(zhuǎn)錄組類型的神經(jīng)元還展示出多種樹突/軸突分布形態(tài)（如單層、雙層分布等），這些形態(tài)類別沿視頂蓋的前后、背腹軸呈現(xiàn)分區(qū)排列的趨勢。由此可見，外在的空間定位因素能夠影響神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生：基因表達(dá)高度相似的細(xì)胞在不同微環(huán)境中可塑造出截然不同的形態(tài)和聯(lián)接模式，與其功能差異相呼應(yīng)。這一系列結(jié)果從分子、功能到形態(tài)三個(gè)層面一致地證明：位置依賴的外部因素?cái)U(kuò)展了轉(zhuǎn)錄組近似神經(jīng)元的表型范圍，挑戰(zhàn)了簡單對(duì)應(yīng)于基因類型的神經(jīng)元分類觀，揭示了發(fā)育和回路結(jié)構(gòu)的區(qū)域特化對(duì)神經(jīng)元多樣性的深刻影響。
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?文章對(duì)我們研究的啟發(fā)
1.神經(jīng)元空間功能：
將該研究范式推廣到其他拓?fù)溆成涞母杏X運(yùn)動(dòng)通路中，進(jìn)一步探索空間位置如何塑造神經(jīng)元功能表型。例如，在哺乳動(dòng)物上丘腦（視頂蓋的同源結(jié)構(gòu)）或初級(jí)感覺皮層中檢驗(yàn)是否存在類似的位置依賴功能分化機(jī)制，以加深對(duì)神經(jīng)元空間維度調(diào)控功能的認(rèn)識(shí)。
2.跨物種發(fā)育比較：
比較不同物種中視頂蓋/上丘腦回路的細(xì)胞類型拓?fù)浣M織和發(fā)育過程。在斑馬魚與哺乳動(dòng)物間對(duì)比神經(jīng)元類型的區(qū)域特化和時(shí)序產(chǎn)生機(jī)制，辨析哪些空間調(diào)控原則在進(jìn)化上是保守的，從而揭示跨物種的神經(jīng)發(fā)育拓?fù)湟?guī)律。
3.形態(tài)功能耦合：
深入研究相同轉(zhuǎn)錄組類型因位置不同而產(chǎn)生形態(tài)和功能差異的分子基礎(chǔ)。聚焦于區(qū)域特異性的信號(hào)通路，如生長因子梯度、軸突導(dǎo)向分子和局部網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)，對(duì)形態(tài)與功能耦合的機(jī)制展開研究，以闡明外部環(huán)境如何通過基因-分子途徑影響神經(jīng)元表型塑造。
4.空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)：
在技術(shù)層面推動(dòng)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的擴(kuò)展和應(yīng)用。例如，開發(fā)更高通量、更高分辨率的原位分子檢測手段，將轉(zhuǎn)錄組測序與空間信息深度融合；并將實(shí)時(shí)功能成像與空間基因表達(dá)圖譜結(jié)合，用于更大尺度的腦組織，繪制全面的細(xì)胞類型-空間-功能三維圖譜。
5.認(rèn)知神經(jīng)調(diào)控：
借鑒本研究對(duì)環(huán)境位置影響神經(jīng)元表型的發(fā)現(xiàn)，探討更高級(jí)腦區(qū)中認(rèn)知功能的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制。例如研究在額葉皮層等區(qū)域，行為狀態(tài)或感覺經(jīng)驗(yàn)如何調(diào)節(jié)同一轉(zhuǎn)錄組類型神經(jīng)元的功能輸出，以及這種調(diào)節(jié)是否也體現(xiàn)空間拓?fù)渖系哪Ｊ剑岳斫庹J(rèn)知過程中細(xì)胞類型功能的可塑性。
6.模型動(dòng)物新用途：
利用斑馬魚這一模型所展示的多模態(tài)分析優(yōu)勢，將類似方法應(yīng)用到其他模型動(dòng)物和腦區(qū)。例如，將轉(zhuǎn)錄組-功能-形態(tài)聯(lián)合分析用于研究與人類疾病相關(guān)的小鼠腦區(qū)，或應(yīng)用于斑馬魚的學(xué)習(xí)、記憶回路，以開拓模型生物在系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)研究中的新用途，幫助解析疾病狀態(tài)下基因與表型的關(guān)系。
7.神經(jīng)回路個(gè)體差異：
針對(duì)不同個(gè)體和條件，研究神經(jīng)元拓?fù)涔δ懿季值目勺冃?。例如，考察遺傳背景差異或不同感覺經(jīng)驗(yàn)下，個(gè)體視頂蓋細(xì)胞類型的空間分布和功能偏好如何改變。此方向的研究將揭示神經(jīng)電路的個(gè)體化和可塑性原理，對(duì)理解大腦如何適應(yīng)發(fā)育和環(huán)境變化以及個(gè)體間行為差異具有重要意義。
