CRISPR基因編輯

CRISPR基因編輯是一項(xiàng)“年輕”的技術(shù)，但在疾病治療中已經(jīng)展示出廣泛的應(yīng)用潛力。在臨床方案中，CRISPR-Cas9往往為組成型表達(dá)，容易導(dǎo)致Cas9核酸酶過(guò)度積累，最終增加其脫靶效應(yīng)的機(jī)率。在更為精確的基因編輯工具中，如：堿基編輯（包括胞嘧啶堿基編輯CBE和腺嘌呤堿基編輯ABE）和先導(dǎo)編輯，類似問(wèn)題依然存在。為此，研究人員試圖探討CRISPR抑制劑的應(yīng)用對(duì)Cas9基因編輯和堿基編輯性能提升的可行性。

研究發(fā)現(xiàn)，一系列CRISPR抑制劑，如：抗CRISPR蛋白Acr，寡核苷酸和噬菌體多肽，能夠通過(guò)可逆的、非共價(jià)的形式來(lái)干擾CRISPR-Cas9的作用過(guò)程。盡管CRISPR-Cas抑制劑種類繁多，這些抑制劑的作用機(jī)制以及治療前景仍然尚未明確。

Cartoon illustrating SINE-mediated modulation of Cas9 mRNA transport

研究?jī)?nèi)容

近日，來(lái)自上海科技大學(xué)的劉佳團(tuán)隊(duì)揭示了一系列能夠提高Cas9基因編輯和堿基編輯特異性的選擇性核輸出抑制劑（SINE）。有趣的是，SINE并不是直接靶向抑制Cas9，而是通過(guò)干擾Cas9 mRNA的核輸出過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)Cas9的作用效果。在人源細(xì)胞中，該團(tuán)隊(duì)成功驗(yàn)證了這些SINE能夠提高CRISPR-Cas9基因編輯、堿基編輯和先導(dǎo)編輯的精準(zhǔn)度。該研究結(jié)果發(fā)表在國(guó)際期刊《Communications Biology》上，題目為KPT330 improves Cas9 precision genome- and base-editing by selectively regulating mRNA nuclear export。

篩選不可逆的CRISPR-Cas9小分子抑制劑

在攜帶“out-of-frame” EGFP報(bào)告基因的HEK293細(xì)胞中，作者加入各種候選化合物并通過(guò)細(xì)胞能否發(fā)出熒光來(lái)判別該化合物是否具有CRISPR-Cas9抑制性。一般情況下，CRISPR-Cas9靶向“out-of-frame” EGFP序列后能夠使EGFP激活。一旦發(fā)現(xiàn)抑制劑，上述過(guò)程將會(huì)被阻斷，EGFP表達(dá)受阻，細(xì)胞不會(huì)發(fā)出綠色熒光。首輪篩選發(fā)現(xiàn)了多個(gè)攜帶邁克爾受體的化合物對(duì)CRISPR-Cas9顯示出抑制性。以此為基礎(chǔ)，作者對(duì)含類似結(jié)構(gòu)的已上市或處于研究階段的化合物進(jìn)行二輪篩選，發(fā)現(xiàn)一系列具有CRISPR-Cas9抑制性的KPT化合物（含F(xiàn)DA批準(zhǔn)的抗癌藥KPT330）。

Identification of SINEs as CRISPR-Cas9 inhibitors

SINE通過(guò)XPO1/HuR或XPO1/LRPPRC通路來(lái)調(diào)節(jié)Cas9 mRNA的核輸出

定量分析結(jié)果顯示，KPT化合物呈劑量依賴性地減少細(xì)胞質(zhì)Cas9 mRNA對(duì)總Cas9 mRNA的占比，這意味著這些化合物主要調(diào)控Cas9 mRNA的胞內(nèi)運(yùn)輸而不是轉(zhuǎn)錄過(guò)程。作者推測(cè)這些SINE的靶點(diǎn)為XPO1，一種負(fù)責(zé)調(diào)控核蛋白和RNA胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

后續(xù)研究提示，KPT330與XPO1相互作用誘導(dǎo)蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過(guò)程，在siRNA對(duì)XPO1的沉默作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步封鎖XPO1對(duì)Cas9 mRNA的核輸出。盡管KPT330需要通過(guò)XPO1下游的銜接蛋白HuR或LRPPRC來(lái)調(diào)節(jié)Cas9 mRNA的核輸出，但不會(huì)直接作用于這些蛋白。

SINEs inhibit the nuclear export of Cas9 mRNA in an XPO1-dependent manner

SINE提升Cas9介導(dǎo)基因編輯的特異性

通過(guò)CRISPR-Cas9靶向編輯與非靶向編輯之間的比率，可以看到各種SINE明顯改善了CRISPR-Cas9編輯HBB和RUNX1基因位點(diǎn)的特異性。在HeLa和HEK293細(xì)胞中，KPT330和KPT8602均能顯著改善CRISPR-Cas9編輯AAVS1、EMX1-2、HBB、FAT和EMX1-3這些基因位點(diǎn)的特異性。相比之下，Acr這種已知能夠改善CRISPR-Cas9特異性的化合物無(wú)法適用于所有測(cè)試的細(xì)胞和/或基因位點(diǎn)。

Evaluation of the effects of SINEs on the genome-editing specificity of CRISPR-Cas9

SINE改善CBE編輯特定區(qū)域的性能

最后，作者還探討了各種SINE對(duì)Cas9堿基編輯和先導(dǎo)編輯性能提升的可行性。盡管KPT185、KPT330、KPT335和KPT8602對(duì)BE3或A3A CBE的靶向和非靶向編輯過(guò)程均顯示出抑制作用，這些SINE對(duì)CBE的非靶向編輯過(guò)程的抑制作用更為顯著，有助于規(guī)避脫靶效應(yīng)。同樣地，在HEK293T細(xì)胞，這些SINE也能抑制多個(gè)基因位點(diǎn)的先導(dǎo)編輯過(guò)程。

Evaluation of the effects of SINEs on base- and prime-editing tools

總結(jié)

總之，該研究首次篩選出一系列CRISPR-Cas9間接、不可逆抑制劑。這些抑制劑（SINE）包含了FDA批準(zhǔn)的抗癌藥KPT330，主要通過(guò)干擾Cas9 mRNA的核輸出過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)Cas9的作用效果，有望用于提高CRISPR-Cas9基因編輯、堿基編輯和先導(dǎo)編輯的精準(zhǔn)度。

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本研究中使用的Cas9 mRNA由APExBIO提供，APExBIO在體外轉(zhuǎn)錄領(lǐng)域深耕多年，可提供體外轉(zhuǎn)錄合成所需的修飾核苷酸、轉(zhuǎn)錄酶、加尾酶和一系列用于mRNA純化、包被、分析和檢測(cè)的產(chǎn)品。此外，公司還提供一系列現(xiàn)成的報(bào)告基因或工具基因mRNA，如EGFP mRNA, Cas9 mRNA等，您可以根據(jù)需求選擇不同的共轉(zhuǎn)錄加帽類型（Cap 0或Cap 1）和修飾核苷酸種類的產(chǎn)品。詳情可前往官網(wǎng)www.apexbio.cn查詢。