文獻信息
標題：Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers
DOI(url): https://www.oncotarget.com/article/13569/text/
日期及雜志：Oncotarget, November 24, 2016
作者及單位：Stephanie N, Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine, Tallahassee, FL 32306, USA
文獻概述(這篇文獻的結論是什么？)
本文討論了來自美國國家癌癥研究所(NCI-60) 60種不同細胞系的細胞外囊泡(EVs)的特征。該研究旨在提供EV的全面蛋白質組學概況，并確定常見的蛋白質貨物以及癌癥類型特異性生物標志物。研究人員在EV中發(fā)現(xiàn)了6071種獨特的蛋白質，其中213種蛋白質是所有細胞系共有的。這些蛋白包括已建立的EV標記和囊泡運輸?shù)鞍住５鞍踪|的差異表達分析揭示了癌癥診斷和預后的潛在生物標志物。網(wǎng)絡分析確定了與囊泡分泌相關的EV成分。EV蛋白質組與全細胞分子圖譜的整合顯示出相似性，這表明EV反映了它們的祖細胞含量，可以作為疾病的指標。該研究強調了EV在癌癥診斷和治療方面的生物標志物發(fā)現(xiàn)和臨床應用的潛力。
文獻結果(每個結果的圖片詳細解讀)
1、癌細胞衍生的EV含有核心囊泡機制
從60個細胞系(NCI-60)中以圖1A的方式收集了EV蛋白。為了檢查已知EV蛋白之間的重疊，將NCI-60 的EV蛋白與Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫中的蛋白進行比較（圖1B），為了增加數(shù)據(jù)嚴謹性，只有在至少2/3細胞系中發(fā)現(xiàn)的蛋白被定義為[NCI-60]stringent，并與數(shù)據(jù)庫進行比較，與數(shù)據(jù)庫有97%以上的重疊（圖1B）。60個細胞系被分類為9個具有代表性的組織學起源:乳腺癌、腦癌(CNS)、結腸癌、腎臟、白血病、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌。在所有組織類型中，每個細胞系平均鑒定出近1900個蛋白質(圖1C)。除了前列腺外，各組組織中發(fā)現(xiàn)的EV蛋白總數(shù)相似(圖1D)，這可能是由于該組織類型的細胞系較少(n=2)。值得注意的是，165種蛋白質僅在白血病來源的ev中發(fā)現(xiàn)，而在其他組織類型中發(fā)現(xiàn)的獨特蛋白質較少。
2、富集分析強調了癌細胞EV蛋白的亞細胞定位和功能
對[NCI-60]stringent中的蛋白進行功能和通路富集，在數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了富含蛋白質定位、運輸和囊泡功能的蛋白質(圖2A)。通路分析顯示，在RNA加工和蛋白水解過程以及細胞骨架和內吞過程中，蛋白質富集(圖2B)。利用FunRich進行亞細胞定位富集。經BH校正后，所有項均顯著(p < 0.001)(圖2C)。圖2D比較了NCI-60細胞系ev中常見EV maker的數(shù)目分布。
3、EV蛋白質組按組織類型聚集，其包含癌癥類型特有的蛋白質
圖3A.基于不同組織類型的囊泡蛋白的PCA圖。圖3B.基于EV蛋白質組譜的細胞系無監(jiān)督分層聚類。Agrin (AGRN)僅在白血病源性ev中不存在(圖3C)。粘附分子ICAM3主要存在于白血病細胞系分泌的EV中(圖3D)。黑色素前體蛋白PMEL存在于所有黑色素瘤細胞類型分泌的囊泡中(圖3E)。Tenascin XB (TNXB)僅在高級別前列腺腺癌細胞系PC-3細胞中發(fā)現(xiàn)豐富水平（圖3F）。
4、保守的囊泡蛋白與EV分泌相關
蛋白質的分層聚類(圖4A)展示了相互關聯(lián)的表達模式，并產生了15個高度相關的蛋白質模塊。含有88個蛋白的黃色模塊與性狀分泌的相關性最顯著（圖4B）。在黃色模塊中，蛋白質顯著性和模塊membership呈正相關(p = 0.006)(圖4C)。黃色模塊的富集分析表明，在細胞粘附和生長、GTPase活性和細胞表面受體信號傳導方面，蛋白質顯著富集(圖4D)，包括CD63、CD81、VAMP3、syntenin-1和SEC22B等EV蛋白。
5、腫瘤囊泡蛋白質組反映了祖細胞的分子組成
圖5A.通過NCI-60 panel對細胞蛋白質組和轉錄組進行共慣性分析。標記代表細胞系在各自蛋白質組或轉錄組空間中的相對位置，其中數(shù)據(jù)集的差異通過連接向量來描繪。驅動組織依賴性聚類的分子被繪制為相同方向上重疊的蛋白質(細胞和囊泡)和RNA轉錄數(shù)據(jù)(圖5B)。特征值的直方圖(圖5C)表明，第一個和第二個共慣性軸代表了在所繪制的數(shù)據(jù)集中所看到的總方差(特征值之和)的49%，分別占方差的31%和18%。還檢查了三個數(shù)據(jù)集，以考慮每個數(shù)據(jù)集貢獻了多少特征值的方差(圖5D)，沒有一個單獨的數(shù)據(jù)集對兩個共慣性軸都有貢獻。比較整個細胞和囊泡蛋白的表達水平發(fā)現(xiàn)，囊泡或細胞中有一些外圍蛋白富集（圖5E-5H）。
文獻方法(使用的生物信息學方法)
1、使用數(shù)據(jù)
60個細胞系（NCI-60）中獲得的EV蛋白，包括6071種蛋白，其中213種蛋白是所有細胞系共有的
細胞蛋白質組數(shù)據(jù)來自http://proteomics.wzw.tum.de/nci60
轉錄組基因表達數(shù)據(jù)下載自NCBI gene expression Omnibus的GSE32474
2、分析方法
從MaxQuant軟件導出原始count數(shù)據(jù)，使用DeSeq2進行差異表達分析并進行歸一化，進一步使用VST函數(shù)進行轉換。對前500個變異蛋白進行PCA分析。
使用R進行加權基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)分析，步驟包括:1)生成蛋白質表達的共表達矩陣，2)將蛋白質相關性轉化為鄰接矩陣用于網(wǎng)絡構建，3)將顯示高相關的蛋白質(模塊)分組在一起，4)將特征蛋白(每個模塊的第一個主要成分)與感興趣的生物性狀相關聯(lián)。
共慣性分析，用于檢測NCI-60細胞系中EV蛋白質組、細胞蛋白質組和轉錄組的相似性。使用R omicade4軟件包，通過共慣性分析顯示樣品與分子分析之間的差異。
使用DAVID v6.7進行功能和通路富集，使用FunRich v3分析cellular compartment的富集。
文章亮點(這篇文獻的優(yōu)點在哪？)
擴充了已知的EV蛋白列表近20%
在這些鑒定的蛋白質中，213種是所有細胞系共有的。這個核心EV蛋白質組可能代表了囊泡的保守結構和信號成分，以及參與囊泡生物發(fā)生和分泌的分子因子，213種蛋白質中有25種被發(fā)現(xiàn)與EV分泌水平呈正相關
我的疑問(這篇文獻的不足在哪？)
- 無法準確定義EV亞型，對解釋EV異質性成果有限
和我相關(我從這篇文獻里學到了什么？)
- 協(xié)慣量分析（co-intertia anaysis ，CoIA）是一種多元統(tǒng)計方法和排序方法，它計算兩個數(shù)據(jù)集內變量交叉的協(xié)方差矩陣，找出兩種數(shù)據(jù)集空間中存在的協(xié)同結構，并將這兩種數(shù)據(jù)集的變量投影到同一空間（也叫協(xié)慣量平面，Co-incritia plane）。CoIA用于衡量兩組數(shù)據(jù)集之間的一致性，它所分析的兩數(shù)據(jù)集之間無解釋變量與響應變量之分，二者無解釋與被解釋關系。CoIA分析與偏最小二乘回歸相關聯(lián)，是經典回歸的可靠替代方法，對于物種-環(huán)境關系的確立，CoIA無需考慮對環(huán)境變量數(shù)量的限制。CoIA分析在生物學領域的多組學研究中應用廣泛，如物種-環(huán)境的交互（微生物群落）、確定兩組環(huán)境變量的相關性或者物種間的共變（微生物群落）、物種組成與功能的關系以及群落功能的一致性等。
