影響因子：7.31
關(guān)于非腫瘤生信，我們也解讀過很多，主要有以下類型
1 單個疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因。
2 單個疾病結(jié)合免疫浸潤，鐵死亡，自噬等基因集，機器學(xué)習(xí)算法等。
3 兩種相關(guān)疾病聯(lián)合分析，包括非腫瘤結(jié)合非腫瘤，非腫瘤結(jié)合腫瘤或者非腫瘤結(jié)合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
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研究概述：
動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性疾病。免疫代謝和氧化應(yīng)激之間存在復(fù)雜的相互作用。為了確定AS中的氧化應(yīng)激和免疫相關(guān)的生物標(biāo)志物。本文利用GEO數(shù)據(jù)集識別并鑒定與氧化應(yīng)激相關(guān)的DEGs。其次利用生物信息學(xué)方法比較AS和對照樣品免疫浸潤水平的差異，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)鑒定出關(guān)鍵的AS診斷標(biāo)志物，并在其他數(shù)據(jù)集中進行了驗證。利用相關(guān)性分析和單細(xì)胞分析，表明ALOX5和NCF2是鐵死亡的差異表達(dá)基因。隨后利用PCR、免疫組化(IHC)和免疫印跡(Western Blot)等實驗證實斑塊組織中相關(guān)基因的表達(dá)。
研究結(jié)果：
一、DEGs的識別及分析
1、對GSE100927數(shù)據(jù)集進行差異基因分析共獲得2417個DEGs，GSEA分析共鑒定出389個OS相關(guān)基因，通過與DEGs交叉獲得74個差異DEOSGs。（圖1a-b、圖2a）
2、GO分析結(jié)果顯示，上調(diào)的DEOSGs在氧化應(yīng)激等方面富集，下調(diào)的DEOSGs在氧化應(yīng)激、肌動蛋白結(jié)合等反應(yīng)中富集（圖2b、d）。
3、KEGG分析顯示，上調(diào)DEOSGs主要富集在糖尿病心肌病、動脈粥樣硬化等途徑，下調(diào)DEOSGs主要富集在肥厚性心肌病和MAPK信號通路等途徑（圖2c、e）
二、免疫浸潤分析及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)共建
1、通過AS和正常樣本中22種免疫浸潤細(xì)胞的富集分?jǐn)?shù)可知，AS和對照組之間有14種免疫細(xì)胞類型存在顯著差異（圖3、4）。
2、矯正樣本后進行WGCNA分析共鑒定出12個相關(guān)模塊，通過模塊的相關(guān)分析和免疫特征分析發(fā)現(xiàn)綠松石模塊與巨噬細(xì)胞M0高度正相關(guān)，藍(lán)色模塊與T細(xì)胞高度正相關(guān)（圖5a-c）。
3、對上述模塊進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩個模塊中基因顯著性（GS）和模塊成員（MM）存在顯著相關(guān)性（圖5d-e）
三、差異表達(dá)的免疫相關(guān)氧化應(yīng)激基因的鑒定及功能富集分析
在以上兩個模塊中觀察到基因間的交集，鑒定出27個差異表達(dá)的免疫相關(guān)氧化應(yīng)激基因（DEIOSGs），GO分析顯示，DEIOSGs主要參與了對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等等；CC分析中DEIOSGs顯著參與了神經(jīng)元細(xì)胞體、內(nèi)吞囊泡和分泌顆粒膜；MF分析顯示DEIOSGs顯著參與了抗氧化活性、血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合；KEGG主要富集于白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、動脈粥樣硬化等途徑（圖6a-c)
四、鑒定Hub基因，并進行表達(dá)及功能分析
1、構(gòu)建DEIOSGs的PPI網(wǎng)絡(luò)并進行可視化分析，共獲得六個Hub基因：NCF2、MMP9、ALOX5、NCF1、NCF4和CYBA。（圖7a-b）
2、Hub基因在AS組中表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平。ROC曲線表明，6個樞紐基因具有良好的診斷價值，MMP9在6個樞紐基因的AUC中最高。（圖8a-b）
3、外部數(shù)據(jù)集驗證發(fā)現(xiàn)，除CYBA外，所有其他基因的AUC區(qū)域均為>0.7。并且5個hub基因之間呈顯著正相關(guān)。（圖8c）
五、關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析
Spearman相關(guān)分析表明，ALOX5、NCF2、MMP9、NCF4、NCF1等5個基因與肥大細(xì)胞活化、巨噬細(xì)胞M0的浸潤呈顯著正相關(guān)，與NK細(xì)胞激活、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞靜止、樹突狀細(xì)胞激活和B細(xì)胞幼稚細(xì)胞的浸潤呈顯著負(fù)相關(guān)（圖9）
六、關(guān)鍵miRNAs、TF和藥物-基因網(wǎng)絡(luò)的GSEA分析和預(yù)測
1、GSEA分析表明，ALOX5、NCF2、MMP9、NCF4和NCF1高表達(dá)隊列中的基因均在同種異體移植排斥反應(yīng)和炎癥中高度富集，表明這5個基因可能與炎癥高度相關(guān)。（圖10a-e）
2、圖11a-b展示了靶向miRNA及TF分析，最后還進行了藥物網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，顯示了21種治療AS患者的潛在藥物。
七、利用單細(xì)胞分析鑒定免疫相關(guān)鐵死亡基因并在體內(nèi)外驗證其表達(dá)
1、將上調(diào)和下調(diào)的DEGs與鐵死亡、焦亡和壞死基因集進行交集，發(fā)現(xiàn)13個鐵死亡相關(guān)的DEGs上調(diào)，10個壞死相關(guān)的DEGs上調(diào)，8個焦亡相關(guān)的DEGs上調(diào)。將上調(diào)鐵死亡相關(guān)的DGEs與藍(lán)色和綠松石模塊中的基因之間的交集，鑒定了4個上調(diào)的免疫相關(guān)鐵死亡基因： ALOX5、NCF2、AURKA和SLC2A6。（圖12a-b）
2、ALOX5和NCF2在巨噬細(xì)胞M1、巨噬細(xì)胞M2和單核細(xì)胞中顯著高表達(dá)。體外實驗顯示ALOX5和NCF1、NCF2、NCF4在AS組中高表達(dá)。（圖13a-13c、圖14a）
3、HE染色顯示APOE-/-小鼠的主動脈瓣斑塊形成面積更大。IHC結(jié)果顯示，AS組的ALOX5和NCF2的陽性區(qū)域均高于對照組。Western Blot結(jié)果進一步證實，ALOX5和NCF2在AS組中的表達(dá)量高于對照組。（圖14b-h）
研究總結(jié)：
免疫浸潤和氧化應(yīng)激在AS中起著重要作用。本研究進行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，以概述AS中的免疫浸潤情況，并聯(lián)合氧化應(yīng)激來預(yù)測AS的診斷基因。此外，本文還探討了鐵死亡與浸潤性免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，并證實了ALOX5和NCF2對動脈粥樣硬化具有良好的診斷價值。該研究為預(yù)測動脈粥樣硬化斑塊的進展提供了新的治療靶點。
