A NAC Transcription Factor Represses Putrescine Biosynthesis and Affects Drought Tolerance

這篇文章是2016年12月份發(fā)表在pp上的，關于枸橘中的一個與腐胺合成和干旱耐受相關的NAC轉錄抑制子。

1. 引言

大量證據表明，非生物脅迫會使植物積累各種不同的代謝產物——比如多胺類物質，來保護植物受到這些脅迫相關的損傷，從而來適應非生物脅迫。植物中有三種主要的多胺：腐胺、亞精胺和精胺。而本文主要研究的是腐胺。

Fig. 1

高等植物中，腐胺可由精氨酸經精氨酸脫羧酶催化而合成。腐胺的進一步積累，會使植物更好地適應非生物脅迫，比如本文中的干旱耐受。之前已經有很多研究報道了不同植物中ADC和腐胺在非生物脅迫中的功能，以及調控ADC的轉錄因子。但是，大部分報道的都是轉錄激活子，是正調控ADC和腐胺的合成。而本文發(fā)現的卻是起負調控作用的轉錄抑制子，枸橘NAC72，這也可以說本文的一個創(chuàng)新點。

Fig. 2

2. 結果

然后我們來看一下，作者是如何展開實驗工作的。

2.1 Yeast One-Hybrid-Based Screening and Sequence Analysis of PtrNAC72

之前工作已經報道了枸橘ADC基因的功能，于是作者通過酵母單雜技術，篩選到了位于ADC上游的轉錄因子，經序列分析發(fā)現是NAC家族的，且與擬南芥NAC072序列相似性最高，就將其命名為PtrNAC72，且發(fā)現N端在不同植物中高度保守，而C端則保守度低。

Fig. 3

Fig. 4

2.2 Expression of PtrNAC72 in Response to Different Stresses and ABA

接著以一個月大的枸橘幼苗為材料，用qRT PCR研究了該轉錄因子在響應冷脅迫、脫水脅迫和ABA時的相對表達水平，說明了確實是脅迫響應基因。

Fig. 5

2.3 PtrNAC72 Functions as a TF and ?also a Transcriptional Repressor of PtADC

然后又以煙草為材料，瞬時表達35S-GFP空載和35S-PtrNAC-GFP融合載體，對該轉錄因子進行亞細胞定位，結果表明定位在細胞核。還進一步以酵母為材料，驗證了轉錄因子的轉錄活性，且C端對轉錄活性很關鍵。

Fig. 6

作者進一步用酵母實驗和EMSA證明了該轉錄因子不僅結合到ADC基因啟動子區(qū)域，而且還是特異性結合到啟動子CACG motif上。轉錄因子活性分為兩種，轉錄激活和轉錄抑制，為了證明該NAC到底是轉錄激活子還是轉錄抑制子，作者又利用雙熒光素酶分析和基于GAL4/UAS分析方法同時表明該轉錄因子是ADC基因的轉錄抑制子。

Fig. 7

2.4 PtrNAC72 Functions to Suppress Putrescine Biosynthesis

為了進一步了解該轉錄因子的功能，作者以過表達的轉基因煙草28和1-1株系以及鑒定到的純合的擬南芥nac72突變體和構建的回復株系為材料，進行轉錄因子功能研究，結果表明，該轉錄因子確實是負調控ADC表達和腐胺的合成。

Fig. 8

2.5 Drought Tolerance Assay Using PtrNAC72-Overexpressing?Plants and the nac72 Mutant

之前實驗室的工作表明，ADC與干旱耐受相關，因此就猜想增加或者降低NAC72的表達豐度，可能會影響干旱響應。于是作者以超表達煙草株系和擬南芥突變體株系為材料，通過表型、存活率、電解質流失率、MDA含量、腐胺含量、水分流失速率等指標來表明對干旱的敏感還是耐受。結果顯示，NAC72確實是在植物響應干旱脅迫方面起著負調控的作用。

Fig. 9

Fig. 10

Fig. 10

2.6 ROS Accumulation and Antioxidant Enzyme Activities under Drought Stress Conditions

因為ROS積累情況也是判斷脅迫耐受程度的一個重要的指標，于是作者又通過DAB和NBT原位染色技術，分別檢測了過表達煙草和擬南芥突變體中過氧化氫和超氧陰離子的含量，同時也測定了清除這兩種ROS的抗氧化酶CAT和SOD的活性，結果表明，干旱脅迫條件下，NAC72在ROS積累，抗氧化物酶的活性方面，起到負調控的作用。

Fig. 11

2.7 Putrescine Levels Correlate with Drought Tolerance in PtrNAC72-Overexpressing Lines and nac72

實驗數據表明，擬南芥突變體中腐胺含量明顯高于野生型，而過表達煙草中腐胺含量低于野生型，加之腐胺也是參與脅迫耐受的，于是作者通過添加ADC抑制劑處理擬南芥和外源添加腐胺處理過表達煙草，并測定腐胺含量，觀察表型，水分流失率，電解質流失率，MDA含量及ROS含量等指標，結果表明，腐胺含量確實與干旱耐受相關，且含量越高，越抗旱。

Fig. 12

Fig. 13

3. 討論

經過一系列實驗，作者最終確實是發(fā)現了了負調控ADC基因的轉錄因子，部分補充完善了ADC調控網絡。但是這些發(fā)現的轉錄因子到底是獨自調控ADC途徑還是相互之間一起作用來調控仍然不清楚。此外，作者還發(fā)現，NAC家族成員能夠識別的靶基因啟動子序列的保守序列模體不僅只有CACG，還有很多其他保守基序，如GCTT等，這就可能跟NAC的Binding domain的氨基酸序列及空間結構有關，涉及到結構生物學問題，進一步研究可以深入了解NAC家族調控機制。最后，還有待解決的問題是，腐胺是通過什么機制來清除ROS的，是通過抗氧化酶嗎，如果是，潛在的機制又是什么？仍然需要進一步闡明。

Fig. 14