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一、序列比對(duì)軟件區(qū)別

• 在對(duì)比對(duì)工具進(jìn)行比較時(shí)，通常將其分為DNA比對(duì)工具（DNA-seq）和RNA比對(duì)工具（RNA-seq）。
• 它們的區(qū)別在于是否會(huì)考慮跨外顯子的比對(duì)，即：是否會(huì)將沒有比對(duì)上的reads劈開，對(duì)劈開后的兩部分再次比對(duì)。（PRO-seq/GRO-seq，它們雖然在建庫時(shí)捕獲的RNA，但是它們的比對(duì)并不需要考慮跨外顯子）
• 常用軟件：
  DNA-seq：BWA；bowtie&bowtie2
  RNA-seq：STAR；HISAT2；Tophat&Tophat2

二、DNA-seq 比對(duì)工具

（一）BWA

• BWA主要應(yīng)用二代測序后的大量短小片段與參考基因組之間的定位比對(duì)。需要先對(duì)參考序列建建立索引，BWA也是基于 BWT和 FM-Index 理論來對(duì)參考基因組做索引。根據(jù)測序方法的不同，有單末端序列(Single-end，SE)比對(duì)和雙末端序列(Pair-end，PE)比對(duì)。

（二）bowtie&bowtie2

• bowtie出現(xiàn)在測序行業(yè)還不成熟的時(shí)候，序列長度普遍在50bp以下，bowtie的只滿足長度在50bp以下的reads的比對(duì)。官方稱其可以把短的DNA序列（35bp）快速的比對(duì)到人類基因組上。
• bowtie2 是一款經(jīng)典的短讀長序列（ 50-100 bp，最多可到1000 bp ) 比對(duì)軟件，節(jié)約內(nèi)存且靈活與成熟的短序列比對(duì)軟件，比較適合下一代測序技術(shù)。支持單端測序（unpaired) 和雙端測序的比對(duì)。支持全局比對(duì)（end-to-end align ) 和 局部比對(duì)( local align )。其通常使用全文分索引(FM-index)以及Burrows-Wheeler 變換(BWT)索引基因組使得比對(duì)非常快速且內(nèi)存高效，但是這種方法不適合于找到較長的、帶缺口的序列比對(duì)
• 結(jié)論：bowtie和bowtie2，是兩個(gè)不同類型的比對(duì)工具，bowtie2并非是bowtie的升級(jí)。尺有所長寸有所短，bowtie適合長度在50b長度以內(nèi)的reads比對(duì)，而bowtie2適合50-100b，甚至更長的reads比對(duì)。但是這兩個(gè)都屬DNA-seq比對(duì)工具

一、RNA-seq 比對(duì)工具

• RNA-Seq測序的特性，天然的會(huì)有一部分?jǐn)?shù)據(jù)延伸到內(nèi)含子區(qū)，這部分跨越外顯子和內(nèi)含子的reads就稱為『junction reads』，所以RNA-Seq比對(duì)軟件需要針對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化。
• junction 和 soft-clip
  1、junction事件：轉(zhuǎn)錄組RNA reads比對(duì)不同于基因組DNA reads比對(duì)(如ChIP-seq、WES等)的地方在于，比對(duì)的reads可能來源于2個(gè)被內(nèi)含子隔開的外顯子區(qū)域，導(dǎo)致reads一端比對(duì)在第一個(gè)外顯子的后面部分，另一端比對(duì)在第二個(gè)外顯子的前面部分，即跨剪切位點(diǎn)，從而形成exon-exon junction (剪接點(diǎn))。這些reads又稱為junction reads，對(duì)轉(zhuǎn)錄本的拼接、鑒定和差異分析具有重要的意義。
  2、soft-clip事件: 即reads末端存在低質(zhì)量堿基或接頭導(dǎo)致比對(duì)不上的， STAR會(huì)自動(dòng)嘗試截去未比對(duì)部分，只保留比對(duì)上的部分 。

（一）STAR

• STAR是ENCODE皇家御用的RNA-seq比對(duì)工具，ENCODE計(jì)劃(ENCyclopedia Of DNA Elements)又稱人類基因組DNA元件百科全書計(jì)劃，是2003年在人類基因組計(jì)劃完成之后緊接著的又一個(gè)大型國際科研項(xiàng)目。

（二）HISAT2

• Tophat2的原作者們也不知道是出于什么考慮，不再更新Tophat2，轉(zhuǎn)而開發(fā)了一個(gè)新的比對(duì)工具HISAT2，更是推薦人們使用HISAT2，聲稱其速度更快，內(nèi)存占用率更小，準(zhǔn)確率更高。
• 此外，HISAT2不僅支持RNA-seq的比對(duì)還支持DNA-seq比對(duì)，唯一需要做的就是加上一個(gè)參數(shù)--no-spliced-alignment。但是就目前來看，大部分人都是使用HISAT2做RNA-seq，沒人使用它做DNA-seq

（三）Tophat&Tophat2

• Tophat/Tophat2工具本身不能進(jìn)行比對(duì)，它是通過調(diào)用bowtie/bowtie2進(jìn)行比對(duì)的。劃重點(diǎn)，bowtie2不是bowtie的升級(jí)版，但是Tophat2是Tophat2的升級(jí)版。因此Tophat只可以調(diào)用bowtie，而Tophat2不僅可以調(diào)用bowtie2（默認(rèn)）還可以更改設(shè)置調(diào)用bowtie。
• Tophat/Tophat2調(diào)用bowtie/bowtie2后，會(huì)首先使用bowtie/bowtie2對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)于那些沒有比對(duì)上的，會(huì)考慮其跨外顯子的可能性，將reads劈開重新比對(duì)。

（四）全長轉(zhuǎn)錄本

• 全長轉(zhuǎn)錄組（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore三代測序平臺(tái)，無需打斷拼接，直接獲得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全長序列及完整結(jié)構(gòu)信息，從而準(zhǔn)確分析有參考基因組物種可變剪接及融合基因等結(jié)構(gòu)信息，克服無參考基因組物種轉(zhuǎn)錄本拼接較短、信息不完整的難題。同時(shí)還可以借助二代測序數(shù)據(jù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本特異性表達(dá)分析，獲得更加全面的注釋信息。

1、GMAP

• 傳統(tǒng)的使用比較多的長讀長比對(duì)軟件是GMAP，05年發(fā)表公布，最開始是用來比對(duì)低通量的EST序列的，后來進(jìn)一步升級(jí)為GSNAP,，其支持高通量的二代測序。
• PacBio測序技術(shù)出現(xiàn)后，GMAP常用于Iso-seq轉(zhuǎn)錄本的鑒定，目前仍是相關(guān)研究引用量最高的比對(duì)軟件，該軟件也一直在持續(xù)更新升級(jí)。其可以將轉(zhuǎn)錄本序列與參考基因組序列比對(duì)，輸出gff文件，比對(duì)速度稍慢。

2、 Minimap2

• Minimap2是生信大牛李恒18年用C語言開發(fā)的可以用于三代數(shù)據(jù)（subreads、iso-seq）比對(duì)的長序列比對(duì)軟件，與傳統(tǒng)的三代比對(duì)工具GMAP相比，其速度有非常顯著的提升，當(dāng)然同時(shí)消耗的內(nèi)存也比較大。使用方法也比較簡單，近幾年引用次數(shù)增長的也很迅速.