說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院助理研究員庫(kù)鑫博士所授。
主要知識(shí)點(diǎn)：
- 蛋白定性檢測(cè)（續(xù)）：搜庫(kù)工具、搜庫(kù)流程、鑒定結(jié)果評(píng)估
- 蛋白定量檢測(cè)：基于MS1的定量、基于MS2的定量
- 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)：SRM/MRM、DIA
蛋白鑒定
搜庫(kù)工具
說到搜庫(kù)，對(duì)于我們使用者來說，其實(shí)并不復(fù)雜，只需要搞清楚以下五個(gè)要素，搜庫(kù)就妥妥的了！
1） 蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)：通常是FASTA格式，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載，如果是未知的蛋白，可以從DNA測(cè)序的序列翻譯成蛋白；最常用的數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot。
2） 特異性酶解：在搜庫(kù)時(shí)要明確使用的蛋白酶是哪一種，比如最常用的胰蛋白酶（軟件會(huì)自動(dòng)識(shí)別它在K或R后面切斷肽段）。如果我們不對(duì)酶切位點(diǎn)進(jìn)行限制，計(jì)算機(jī)只好把所有的可能都窮盡一遍，產(chǎn)生非常多可能的肽段，不僅運(yùn)行時(shí)間會(huì)非常長(zhǎng)，而且錯(cuò)誤匹配的可能性也會(huì)高很多。
3） 轉(zhuǎn)錄后修飾：分兩類，一種叫固定修飾，即在某種氨基酸殘基上一定出現(xiàn)的特定基團(tuán)修飾，比如加入乙?；噭┻M(jìn)行乙酰化修飾；另一種叫可變修飾（動(dòng)態(tài)修飾），就是說某一種氨基酸殘基可能會(huì)被某種基因修飾（被修飾的可能性比較大），例如甲硫氨酸的氧化等。
4） 碎片類型：上一篇專門講過，比如CID或HCD碎裂產(chǎn)生by離子，搜索引擎就只按by離子的規(guī)則切割；沒特別的原因，不建議大家再加入其它離子類型，不然會(huì)大大延長(zhǎng)搜庫(kù)時(shí)間，還會(huì)引入錯(cuò)誤；如果是ETD碎裂則會(huì)產(chǎn)生cz離子，而QTOF會(huì)產(chǎn)生ax離子。搜庫(kù)軟件通常會(huì)根據(jù)我們指定的儀器類型來自動(dòng)判斷碎片離子的類型。
5） 選擇合適的搜庫(kù)軟件：接下來詳聊。
小編明白，大伙兒通常都比較關(guān)心用哪款搜庫(kù)軟件，能最快最好地解決自己的問題。根據(jù)課堂上學(xué)到的內(nèi)容，小編給大伙兒逐一介紹目前最常用到的搜庫(kù)軟件，以及它們各自的特點(diǎn)。
首先出場(chǎng)的是世界上第一款搜庫(kù)軟件SEQUEST！雖然幾經(jīng)升級(jí)更新，它仍然保留了最初設(shè)計(jì)時(shí)的基本架構(gòu)，并且仍然被廣泛使用。SEQUEST的思路主要分兩步走：先對(duì)匹配結(jié)果給出一個(gè)預(yù)打分，然后再通過全局的評(píng)估打出最后得分。目前整合了SEQUEST搜庫(kù)方法的軟件還有Proteome Discovery、X!Tandem、Comet等。
第二款軟件是被認(rèn)為是目前世界上使用最為廣泛的搜庫(kù)工具M(jìn)ascot，由英國(guó)Matrix Science公司研發(fā)(www.matrixscience.com，國(guó)內(nèi)的代理商為康昱盛公司)。它與SEQUEST的搜庫(kù)算法完全不同，是基于概率的打分。它之所以廣愛歡迎，主要有以下幾個(gè)特點(diǎn)：
能給出清楚明了的搜庫(kù)結(jié)果報(bào)告；
對(duì)蛋白的鑒定率很高；
可以整合和分析幾乎所有主流的質(zhì)譜儀器原始數(shù)據(jù)；
搜索速度很快。
還有一款開源軟件也值得介紹給大家：X!Tandem。它的打分算法其實(shí)與SEQUEST是一樣一樣的，但搜庫(kù)速度相當(dāng)快，近年來用戶數(shù)增長(zhǎng)很顯著，感興趣的小伙伴們可以訪問以下網(wǎng)站獲取更多的信息：www.thegpm.org
除了以上三種搜庫(kù)軟件，目前我們能看到的類似的工具還有很多很多，比如Comet, OMSSA, InsPecT, MyriMatch, Phenyx, SpectrumMill, ProteinPilot等等。其實(shí)這些軟件的處理步驟都是搜庫(kù)和打分，但它們所使用的算法思路又各不相同。推薦給大伙兒的做法是，選擇兩個(gè)基于不同算法的搜庫(kù)軟件，分別進(jìn)行打分，然后將結(jié)果合并，可以得到比單用一種搜庫(kù)算法高一些的鑒定結(jié)果。
搜庫(kù)流程
說到底，搜庫(kù)軟件在報(bào)告最終的匹配結(jié)果之前，到底都做了些什么操作呢？
首先，把質(zhì)譜儀得到的譜圖輸入搜庫(kù)軟件。對(duì)于搜庫(kù)軟件來說，碎片離子的信息越豐富越好。如果最后給出的搜庫(kù)結(jié)果不好，建議大伙兒點(diǎn)開二級(jí)譜圖檢查一下，是否因?yàn)樗槠畔⑻俣斐傻模蛘呤且驗(yàn)槎?jí)碎片的intensity太低。
大伙兒要記得，二級(jí)碎片的信息主要是用來做蛋白序列信息推導(dǎo)的，如果二級(jí)譜圖給我們的信息太少，就很難做出一個(gè)好的鑒定結(jié)果。二級(jí)譜圖質(zhì)量不高有各種可能的原因，比如樣品本身的原因，或者質(zhì)譜儀的原因，這個(gè)要根據(jù)實(shí)際情況來逐一排查。
（對(duì)于我們這些小白來說，如果你拿到搜庫(kù)軟件只會(huì)點(diǎn)點(diǎn)鼠標(biāo)，那就是入門一級(jí)的水平，如果你還會(huì)打開二級(jí)譜圖查看一番，那就升到二級(jí)了_ 這也是為啥雖然并不需要自己寫搜庫(kù)軟件，咱們還是要學(xué)習(xí)一下搜庫(kù)原理。）
除了譜圖，還將讀入母離子及電荷狀態(tài)等信息，這些都存儲(chǔ)于RAW文件中，所以我們只需要輸入RAW文件，并指定之前談到的五個(gè)變量，就可以開始搜庫(kù)了。
搜庫(kù)軟件通過以下五步來實(shí)現(xiàn)譜圖的正確匹配：
1） 從數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇分子量與輸入值相等的肽段；
2） 生成理論碎片，并生成理論譜圖；
3） 將實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖進(jìn)行匹配；
4） 對(duì)匹配進(jìn)行打分；
5） 將打分進(jìn)行排序，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定最佳的匹配結(jié)果并導(dǎo)出。
來，我們看一張形象點(diǎn)的圖，再來理解一下這五步到底是怎么實(shí)現(xiàn)的。
假設(shè)我們的譜圖檢測(cè)到的是一條1000分子量的肽段，則搜庫(kù)軟件首先會(huì)在蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)里對(duì)所有可能的蛋白序列進(jìn)行特定位點(diǎn)的酶切（酶切位點(diǎn)由我們指定的特異性酶參數(shù)來決定），然后選出分子量1000左右的肽段，根據(jù)指定的儀器類型，模擬打碎成理論上的碎片離子，然后生成理論譜圖，再與輸入的實(shí)際譜圖進(jìn)行比對(duì)，得到一個(gè)相似性打分，按得分高低進(jìn)行排序，最后挑選出匹配結(jié)果。
鑒定結(jié)果評(píng)估
聽上去整個(gè)過程并不復(fù)雜，對(duì)不對(duì)？事實(shí)上，由于各種因素對(duì)搜庫(kù)匹配的影響，這里面最重要的問題是，怎么判斷哪些鑒定結(jié)果是對(duì)的！也就是說，我們需要對(duì)匹配結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。
在過去，評(píng)估的大部分工作需要手工完成。下面這個(gè)餅圖大伙兒感受一下：整個(gè)樣品制備+質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)+數(shù)據(jù)庫(kù)搜索只占了25%的時(shí)間，而對(duì)結(jié)果的手工驗(yàn)證要花掉75%的時(shí)間！是不是很可怕！
還好，我們已經(jīng)不用再受這種折磨了，如今的各種搜庫(kù)軟件都自帶統(tǒng)計(jì)學(xué)算法來幫我們進(jìn)行評(píng)估，幸福感頓時(shí)提升了好幾個(gè)數(shù)量級(jí)！
目前主流的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估算法有兩種思路：
target-decoy 也就是通常所說的正庫(kù)反庫(kù)策略
peptideprophet 基于概率的打分
蛋白定量
為什么要做定量，這個(gè)大概不用小編多啰嗦了吧？總之，定量檢測(cè)可以研究不同生理狀態(tài)及不同時(shí)間點(diǎn)上各種蛋白表達(dá)量的變化，研究意義是大大的有??！
在質(zhì)譜史前時(shí)代，是2D膠的天下。前面也提過，2D膠的通量、準(zhǔn)確性以及可重復(fù)性都沒法跟質(zhì)譜比。
說到利用質(zhì)譜對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，可以分為基于MS1（一級(jí)譜圖）的定量，以及基于MS2的定量。啥意思呢？基于MS1的定量是指根據(jù)一級(jí)譜圖的信息得到定量結(jié)果，同理，基于MS2的定量是指根據(jù)二級(jí)譜圖的信息得到定量結(jié)果。聽上去很高深吧？別怕，聽小編逐一給你解釋。
基于MS1的定量
基于MS1的定量方法最早是ICAT（ICAT是標(biāo)記試劑的名字，這種定量方法現(xiàn)在用得很少了），現(xiàn)在常用的SILAC，以及l(fā)abel free非標(biāo)記定量。我們來說說SILAC定量策略。
SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies）翻譯過來就是穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，說得簡(jiǎn)單一點(diǎn)，就是想辦法把非天然同位素?fù)降诫亩卫锎嫣烊煌凰?，然后?jì)算譜圖里各個(gè)同位素的峰面積，其差值就對(duì)應(yīng)著蛋白相對(duì)量的變化。
通常呢，我們是利用C13或者N15這類穩(wěn)定的同位素（叫做重標(biāo)），用培養(yǎng)基或者飼料對(duì)細(xì)胞或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行培養(yǎng)或喂食。大伙兒應(yīng)該知道吧，有一類氨基酸叫必需氨基酸，比如Lys和Arg，是生物體自身無(wú)法合成的，需要從外界攝入。于是，從外界攝入的過程中，Lys和Arg里包含的C12或N14，就被C13或N15取代了。
妙的是，Lys和Arg又正好是胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，所以它又能保證每條切出來的肽段至少有一個(gè)Lys或Arg，也就是說，每條肽段上至少有一個(gè)殘基是有同位素標(biāo)記的，完美！
SILAC的標(biāo)記效率很高，比如細(xì)胞培養(yǎng)，通常5、6代以后，同位素標(biāo)記就有95%左右的比例了。重標(biāo)標(biāo)記好后，將沒有同位素標(biāo)記的樣品（通常叫輕標(biāo)）與重標(biāo)的樣品1：1混合，經(jīng)過分離、酶切等步驟，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。得到的譜圖會(huì)有對(duì)應(yīng)的兩個(gè)峰，峰面積的差值就是不同樣品中相應(yīng)蛋白的相對(duì)量的變化了。
所以，SILAC定量是一種相對(duì)定量方法，我們只能得到兩組樣品之間每種蛋白含量的差異值，而無(wú)法知道它們的絕對(duì)量。
如果你有三組樣本想要進(jìn)行SILAC定量，我們可以把C13和N15標(biāo)記組合一下，比如輕標(biāo)（不標(biāo)記）、中標(biāo)（C13標(biāo)記）和重標(biāo)（C13和N15共同標(biāo)記），然后三組樣品1：1：1混合。
怎么把同位素標(biāo)記上去這件事情，方法有很多，可以分為代謝同位素標(biāo)記，化學(xué)方法標(biāo)記，酶反應(yīng)標(biāo)記。比如我們剛才舉例的細(xì)胞培養(yǎng)，就屬于代謝同位素標(biāo)記，這也是其中最常用的方法；通過化學(xué)反應(yīng)在特別的肽段上加一個(gè)基團(tuán)這種方法叫做化學(xué)方法標(biāo)記；酶切的時(shí)候在斷裂位點(diǎn)標(biāo)記這種方法在酶反應(yīng)標(biāo)記（通常使用O18同位素）
剛才小編在講到SILAC定量時(shí)，云淡風(fēng)輕地提到峰面積。有沒有童鞋對(duì)“峰面積”到底是什么心存疑惑呢？小編用一張圖告訴你：
上圖是在時(shí)間軸上從一級(jí)質(zhì)譜得到的多張譜圖，在荷質(zhì)比軸上的每一根小柱子代表的是肽段在不同時(shí)間點(diǎn)上被檢測(cè)到的值，我們用黃色小柱子表示其中一種肽段，將這四個(gè)黃色小柱子的頂點(diǎn)連起來，就可以畫出一個(gè)峰型，這個(gè)峰的面積就是肽段的量（通過若干肽段的量我們可以推出蛋白質(zhì)的量）。
對(duì)這個(gè)圖，小編的理解是，假設(shè)質(zhì)譜掃描的速度是無(wú)限地快，相當(dāng)于可以把一個(gè)時(shí)間段分為無(wú)數(shù)個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)上都能掃描得到一個(gè)值（小柱子），然后在時(shí)間軸上把這些值全部加起來（做積分）于是就得到了這個(gè)肽段的量。
基于MS2的定量
扯完了基于MS1的定量，我們繼續(xù)扯基于MS2的定量，也就是基于報(bào)告離子的定量。在Shotgun領(lǐng)域主流的方法是iTRAQ和TMT，不要被這些名字嚇到，其實(shí)就是兩種試劑的名字，而且原理和操作方法都差不多。以iTRAQ為例，先來一張清新的示意圖洗洗眼：
圖的左側(cè)就是iTRAQ試劑的分子式，如果你覺得太小了看得不爽，那小編再來貢獻(xiàn)一張更大更簡(jiǎn)明的：
大伙兒看懂了嗎？iTRAQ試劑分三個(gè)部分：報(bào)告離子（就是最終要進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)的）、平衡離子（連接報(bào)告離子與反應(yīng)離子），以及與肽段反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)。
說起來，這個(gè)iTRAQ試劑也是很妙的，它這三個(gè)基團(tuán)里含有一堆同位素，每種同位素的總量是一個(gè)固定的值，但具體位置可以變化，主要體現(xiàn)在報(bào)告離子上的變化，于是我們可以得到幾種不同的報(bào)告離子。
說得詳細(xì)點(diǎn)兒，假設(shè)（只是假設(shè)哈），我們同時(shí)用了四個(gè)C13，四個(gè)N15來標(biāo)記整個(gè)iTRAQ分子，無(wú)論這四個(gè)C13和四個(gè)N15的位置有多么不同，大家總的分子量都是一樣的。但對(duì)于報(bào)告離子來說，可以有變化，比如第一個(gè)報(bào)告離子被標(biāo)記了一個(gè)C13，第二個(gè)報(bào)告離子被標(biāo)記了一個(gè)N15，第三個(gè)標(biāo)記了C13+N15，第四個(gè)標(biāo)注記C13+C13+N15.
由于可以做這樣的位置組合，我們常聽到的iTRAQ“四”標(biāo)或者“八”標(biāo)，就是指標(biāo)記位置的不同組合的數(shù)量。以四標(biāo)為例，在MS1時(shí)就通過iTRAQ試劑中的反應(yīng)基團(tuán)將整個(gè)iTRAQ試劑標(biāo)記在肽段上，這里面包含了四種同位素標(biāo)記的組合，但由于它們總的分子量都相同，對(duì)樣品不會(huì)產(chǎn)生什么影響。
好，接下來我們將標(biāo)記好的樣品送入二級(jí)質(zhì)譜，經(jīng)過與惰性氣體的碰撞碎裂，iTRAQ試劑會(huì)按它固定的方式將報(bào)告離子碎裂出來，于是，四種標(biāo)記位置不同的iTRAQ試劑碎裂后，得到四種分子量不同的報(bào)告離子！將這四種報(bào)告離子混合以后得到譜圖，根據(jù)譜峰面積可以推導(dǎo)它們各自標(biāo)記的肽段的量。是不是很機(jī)智的一種方法？
我們還是以四標(biāo)為例，報(bào)告離子的荷質(zhì)比分別是114，115，116，117，于是，在二級(jí)譜圖的110-120的范圍里，我們會(huì)看到一個(gè)與by離子完全不同的非常高的峰，就像這樣：
這就是iTRAQ方法標(biāo)志性的峰！把這個(gè)峰放大，我們就能清楚地看到四個(gè)峰，就是對(duì)應(yīng)的四個(gè)通道。像下面這樣：
Tips:
用iTRAQ方法定量的時(shí)候，質(zhì)譜儀的參數(shù)需要根據(jù)試劑碎裂時(shí)的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，就是說，要將報(bào)告離子充分地碎裂出來，才能保證它可以被穩(wěn)定可靠地檢測(cè)。
大伙兒如果能基本理解iTRAQ四標(biāo)的原理，對(duì)于iTRAQ八標(biāo)，TMT六標(biāo)或者十標(biāo)，都可以類推了。只需要注意的是，iTRAQ與TMT試劑來不同的質(zhì)譜儀公司，因此對(duì)質(zhì)譜儀也有選擇性的，大家在選擇到底用哪種標(biāo)記試劑的時(shí)候，除了要考慮標(biāo)記的樣本數(shù)，也要考慮對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜儀品牌和類型了。
靶向蛋白質(zhì)組學(xué)
前面我們聊過了蛋白質(zhì)組學(xué)的定性檢測(cè)與定量檢測(cè)，接下來我們整點(diǎn)兒更前沿的，代表著未來一個(gè)重要發(fā)展方向的東西：靶向蛋白質(zhì)組學(xué)！
話說，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)如火如荼的今天，最能代表有機(jī)體當(dāng)下生命狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)，如何大規(guī)模地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域呢？與基因組學(xué)相比，蛋白質(zhì)組學(xué)目前的瓶頸到底在什么地方呢？
簡(jiǎn)單說來，蛋白質(zhì)組學(xué)的著力點(diǎn)一直是研發(fā)更高通量的技術(shù)平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)更多未知的蛋白。當(dāng)我們轉(zhuǎn)身關(guān)注生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時(shí)才發(fā)現(xiàn)，人家并不需要一次檢測(cè)上萬(wàn)個(gè)蛋白這么高的通量，但是卻需要在大量的樣本中，高度穩(wěn)定地重復(fù)地檢測(cè)幾十個(gè)幾百個(gè)蛋白。
比如說，當(dāng)我們?cè)噲D把蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段用于臨床生物標(biāo)志物的研發(fā)時(shí)，走到第二步就卡住了！要在上百個(gè)樣本中重復(fù)檢測(cè)一些候選標(biāo)志物蛋白質(zhì)，真的很困難?。?/p>
這種困難是什么造成的呢？最重要的原因是，也就是 Shotgun方法的局限性，它只適合檢測(cè)高豐度蛋白，含量不夠高的蛋白很容易漏檢，而這些卻往往是真正可能的生物標(biāo)志物。此處請(qǐng)大家腦補(bǔ)一下小編介紹DDA（數(shù)據(jù)依賴性采集）時(shí)提到的，低豐度蛋白進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜的機(jī)會(huì)都很少！對(duì)于低豐度蛋白，可能出現(xiàn)的結(jié)果就是，一會(huì)兒檢測(cè)到了，一會(huì)兒又檢測(cè)不到…這叫人怎么忍？
以血液中包含的蛋白為例，大家感受一下，紅色的都是非候選標(biāo)志物，但含量都非常高。余下的低豐度蛋白我們又搞不定。這么看來，對(duì)于臨床應(yīng)用，蛋白質(zhì)組學(xué)還有希望嗎？
2012年，一種新的方法被nature method選為年度新方法，認(rèn)為是未來發(fā)展的大趨勢(shì)，它的名字就叫靶向蛋白質(zhì)組學(xué)！于是，希望來了~
靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)到底是怎樣的不同？它大體上可以分為幾類：MRM/SRM、PRM、SWATH/DIA。大伙兒就跟著小編來了解一下其中兩種比較有代表性的吧~
SRM/MRM
先來名詞解釋一下：
SRM：Selective Reaction Monitor（選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)），就是先只選擇一個(gè)肽段離子，碰撞后，從形成的碎片離子中也只選一個(gè)離子，進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)閮刹蕉贾贿x單離子，針對(duì)性很強(qiáng)，可以排除噪音和干擾的影響。
MRM：Multi Reaction Monitor（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）就是多個(gè)化合物同時(shí)測(cè)定時(shí)，多個(gè)SRM一起做。不需要特意區(qū)分SRM和MRM，只要一次實(shí)驗(yàn)是同時(shí)做幾個(gè)SRM，就是MRM方式了。
概括來說，由于MRM/SRM預(yù)先選定了需要分析的肽段及碎片離子，而不像之前的方法，眉毛胡子一把抓，這樣可以繞過一級(jí)質(zhì)譜中只能選擇高峰度Tops的標(biāo)準(zhǔn)，從而保證低峰度蛋白可以不受影響。
第一篇MRM/SRM應(yīng)用的文獻(xiàn)于2009年發(fā)表在CELL上的，對(duì)酵母全蛋白組做了精確定量，覆蓋了從1E6 copies/cell 到100 copies/cell的蛋白，無(wú)一遺漏，是不是很贊?。–ell 138, 795-806, Auguest21, 2009）
另一個(gè)激動(dòng)人心的應(yīng)用發(fā)表于2013年，利用MRM/SRM技術(shù)成功研發(fā)出肺癌篩選的試劑盒，從371個(gè)候選蛋白中選出13個(gè)蛋白的panel作為檢測(cè)目標(biāo)。該試劑盒已得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)，在美國(guó)上市使用，進(jìn)入醫(yī)保支付范圍。感興趣的小伙伴們可以找文獻(xiàn)來研讀一下（Sci Transl Med 5, 207ra142, 2013）.
還有一種與MRM/SRM很類似的方法，叫PRM。它唯一的不同是，MRM/SRM的母離子和子離子都需要預(yù)先選定，而PRM只需要選定母離子，而不需要預(yù)選子離子。這是因?yàn)镻RM是在高精度的Orbitrap質(zhì)譜儀上做（MRM/SRM是在三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀上做），由于精度夠高，可以對(duì)多種子離子同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。由于不需要選定子離子，PRM方法實(shí)施起來更容易，而MRM/SRM則需要針對(duì)子離子不斷優(yōu)化儀器參數(shù)。
DIA
MRM之類的技術(shù)，需要預(yù)先選定多肽及肽段離子，那么問題就來了，如果我們想發(fā)現(xiàn)點(diǎn)新的東西呢？我沒法預(yù)先選定??！
這種情況下，你需要關(guān)注的就是第二種代表性的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)DIA（data-independent acquisition）了，也就是“數(shù)據(jù)非依賴性采集”策略。
DIA的一個(gè)代表性方法叫SWATH技術(shù)（由蛋白質(zhì)組學(xué)泰山北斗Ruedi教授所在的蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院與AB SCIENX公司合作將這個(gè)方法商業(yè)化）。它的基本思路是：選擇母離子的質(zhì)荷比m/z在500-900或400-1000左右的范圍內(nèi)，每25Dal作為一個(gè)窗口，比如，先分離500-525這個(gè)范圍的肽段，然后碎片化，接下來采集525-550分子量范圍的肽段，依次類推。
DIA的一級(jí)質(zhì)譜可以很均勻地采集每個(gè)范圍窗口的肽段，不會(huì)有遺漏，不涉及到對(duì)母離子的限制性篩選，所以無(wú)論是準(zhǔn)確性還是可重復(fù)性，與DDA相比都得到了很好的提升，前途一片大好！
不過呢，細(xì)心一點(diǎn)的童鞋就會(huì)發(fā)現(xiàn)，DIA一次采集的范圍有25Dal，顯然是很寬的了！這就意味著，每一次放進(jìn)來的肽段會(huì)很多，產(chǎn)生的碎片離子也非常復(fù)雜，于是我們會(huì)拿到非常復(fù)雜的譜圖。
如果用以往的搜庫(kù)方法，拿理論譜圖去匹配這么復(fù)雜的真實(shí)譜圖，很容易漏掉很多信息，準(zhǔn)確率沒法保證。怎么辦呢？DIA的策略是，先收集真實(shí)的譜圖庫(kù)，然后拿實(shí)驗(yàn)譜圖與真實(shí)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，來鑒定肽段。
當(dāng)然啦，即便如此，DIA復(fù)雜的譜圖仍然給后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)帶來很多挑戰(zhàn)，也激起了各種大神的興趣！在這一兩年的各種蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議上，如果大伙兒留意的話，會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)DIA數(shù)據(jù)分析的技術(shù)討論是相當(dāng)?shù)幕馃?！我們也期待著DIA領(lǐng)域的突破和發(fā)展！
