一：慢病毒感染導致細胞狀態(tài)變差的表現(xiàn)：

慢病毒感染后：

①細胞培養(yǎng)皿的皿底（不是細胞內(nèi)）出現(xiàn)大量黑點，在排除支原體污染后，最可能的原因是細胞大量死亡后留下的細胞碎片；

②細胞形態(tài)變圓、變得透亮，這種情況下是觸發(fā)了細胞的免疫反應(yīng)，引起細胞凋亡；

③細胞變得瘦長，不再飽滿；

④細胞長勢變慢。

二：細胞狀態(tài)變差的原因：

1.過表達了致死基因，或者敲低了細胞的關(guān)鍵基因，這種情況下可能導致感染了病毒的細胞無法進行長期培養(yǎng)和實驗，因此可以構(gòu)建可誘導表達的慢病毒載體。

2.病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素等會對細胞造成一定的毒性，不同細胞對毒性的耐受力不同。如果所選擇的目的細胞對慢病毒比較敏感，則可能出現(xiàn)細胞狀態(tài)變差甚至死亡的現(xiàn)象。

①；②，可增加鋪板細胞的融合率（可提高至70%），或調(diào)整感染時加入的病毒量；③。

三：慢病毒感染細胞注意要點：

1.細胞感染的時機：

保證感染前細胞的生長狀態(tài)良好；

在對數(shù)期生長的細胞中加入病毒，①可在細胞貼壁后加入病毒液；②在細胞傳代時（即細胞尚未貼壁時）加入病毒液。根據(jù)經(jīng)驗，第二種方法的效果更好。

2.病毒的用量：

①購買的慢病毒：一般都有測過病毒滴度，因此可以根據(jù)滴度計算MOI值，MOI代表了一個細胞可能被病毒顆粒感染的次數(shù)，對大多數(shù)細胞來說，MOI值為10-15時最佳，若病毒一次用量太高，容易造成細胞大量死亡或凋亡?？蛇x擇使用高純度高滴度的慢病毒，并適當降低感染時使用的MOI值。

②對于自己構(gòu)建載體后利用慢病毒系統(tǒng)包裝形成的病毒，則需要用一個病毒梯度來選擇最佳方案，既不能直接導致細胞凋亡，也不能表達倍數(shù)過低。

③根據(jù)細胞狀態(tài)，可選擇在感染4小時后換液，用新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察

④若需要增加表達倍數(shù)，可以分批、分次感染。先感染48h，用載體對應(yīng)的抗生素篩選48h；待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，再次加入病毒，重復(fù)感染步驟。

3.PCR驗證及WB驗證時間：

在最后一次感染后，再培養(yǎng)2代，方可收樣進行驗證。因為病毒感染對細胞來說，是一種stress，處于脅迫狀態(tài)下的細胞狀態(tài)會和正常細胞有所區(qū)別。在病毒感染的情況下，細胞免疫系統(tǒng)會被激活，因此，如果研究對象是免疫相關(guān)的基因，則受到的影響會更大。