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2025年12月16日，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院聯(lián)合中科院大學(xué)、華大研究院和北京化工大學(xué)等多個團(tuán)隊，在雙1區(qū)TOP期刊《Cell Reports Medicine》發(fā)表題為“Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer”的科研成果。研究聚焦3型髓母細(xì)胞瘤（Group 3 Medulloblastoma, G3-MB）這一預(yù)后差、腫瘤干性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高的兒童惡性腦腫瘤亞型，發(fā)現(xiàn)超級增強(qiáng)子（Super-Enhancer, SE）低甲基化是維持G3-MB干性和腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵表觀遺傳機(jī)制，而Otx2超級增強(qiáng)子低甲基化是G3-MB患者的預(yù)后標(biāo)記物和潛在治療靶點。
研究團(tuán)隊利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術(shù)繪制了189例未經(jīng)治療MB樣本的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜，并綜合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（snRNA-seq）和染色質(zhì)可及性（snATAC-seq）數(shù)據(jù)，系統(tǒng)揭示了G3-MB中SE低甲基化的表觀遺傳表征。研究發(fā)現(xiàn)，Otx2基因超級增強(qiáng)子低甲基化是維持腫瘤干性和驅(qū)動惡性進(jìn)展的核心機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子OTX2通過招募DNA去甲基化酶TET3，特異性介導(dǎo)Otx2 SE區(qū)域DNA去甲基化，形成OTX2-TET3正反饋自調(diào)控環(huán)路，從而維持OTX2高表達(dá)和腫瘤干性?；谏鲜鼋Y(jié)果，研究開發(fā)了脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)，通過TET3抑制劑（Bobcat339）或siRNA，在患者來源的異種移植瘤模型中顯著抑制腫瘤生長，為G3-MB這一高危亞型提供了新的預(yù)后標(biāo)記物和靶向治療策略。
英文標(biāo)題：Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer
譯文標(biāo)題：靶向TET3通過破壞Otx2超級增強(qiáng)子低甲基化抑制3型髓母細(xì)胞瘤干性和進(jìn)展
發(fā)表時間：2025年12月16日
發(fā)表期刊：Cell Reports Medicine
影響因子：IF10.6/Q1
技術(shù)平臺：WGBS等
作者單位：北京天壇醫(yī)院、中科院大學(xué)、華大研究院、北京化工大學(xué)、北京兒童醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)等
DOI:10.1016/j.xcrm.2025.102474
易小結(jié)
本研究從表觀遺傳調(diào)控的嶄新視角，不僅揭示了“增強(qiáng)子低甲基化-染色質(zhì)開放-癌基因激活”這一核心通路，更將基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為治療潛力，標(biāo)志兒童腦腫瘤研究從分子分型走向機(jī)制驅(qū)動的精準(zhǔn)治療。
WGBS技術(shù)在本研究中單堿基分辨率繪制了DNA甲基化圖譜，精準(zhǔn)捕獲增強(qiáng)子等遠(yuǎn)端調(diào)控元件的甲基化變化。未來WGBS結(jié)合多組學(xué)分析，有望在更多復(fù)雜疾病中揭示新的表觀遺傳驅(qū)動因子和治療靶點。
研究方法
1、隊列與樣本
發(fā)現(xiàn)隊列：80例未經(jīng)治療的MB樣本，經(jīng)病理確診、知情同意及倫理審批
驗證隊列：109例獨(dú)立MB樣本，用于DMR分子分型穩(wěn)定性驗證
已發(fā)表數(shù)據(jù)：GEO數(shù)據(jù)庫（DNA甲基化芯片及RNA-seq，567例）、EGA數(shù)據(jù)庫（正常小腦WGBS）
2、多組學(xué)測序分析
全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）：對樣本進(jìn)行高深度（平均~16.38X）測序，獲得全基因組單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，并進(jìn)行分子分型與差異甲基化區(qū)域（DMR）分析。
Bulk RNA測序（RNA-seq）：對169個樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，關(guān)聯(lián)甲基化與基因表達(dá)。
單核RNA測序（snRNA-seq）與單核ATAC測序（snATAC-seq）：分別對9個和8個G3-MB樣本進(jìn)行，解析腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞狀態(tài)及染色質(zhì)可及性。
3、分子機(jī)制驗證實驗
機(jī)制驗證：染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）、CUT&Tag-seq（TET3）、染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Hi-C）、報告基因?qū)嶒灐⒚庖吖渤恋恚–o-IP）、定量甲基化特異性PCR（qMSP）等，驗證OTX2與TET3的互作、結(jié)合及對Otx2 SE的調(diào)控。
功能驗證：在D283、D458等G3-MB細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲低/過表達(dá)、細(xì)胞增殖、侵襲、分化（檢測Ki-67, NeuN等標(biāo)記物）實驗。
4、臨床前治療驗證
納米藥物開發(fā)：構(gòu)建負(fù)載TET3抑制劑Bobcat339或siTET3的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）。
體內(nèi)模型：建立基于細(xì)胞系（D283）和患者來源腫瘤組織（PDX）的小鼠/大鼠原位移植瘤模型。
療效評估：通過腦部顯微MRI監(jiān)測腫瘤體積，進(jìn)行生存分析，并通過組織學(xué)染色評估增殖、分化和侵襲標(biāo)記物變化。
結(jié)果圖形
（1）整合表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組分析重現(xiàn)髓母細(xì)胞瘤分子亞型
本研究首先建立了基于WGBS的MB分子分型體系。研究發(fā)現(xiàn)基于發(fā)現(xiàn)隊列80例樣本的全基因組DNA甲基化圖譜可以準(zhǔn)確地將MB分型為WNT-MB、SHH-MB、G3-MB和G4-MB四個亞型（圖1A）；驗證隊列109例樣本基于相同DMR集合同樣實現(xiàn)穩(wěn)定聚類（圖1B）。上述研究結(jié)果表明DNA甲基化是MB亞型的穩(wěn)定標(biāo)記物，并初步揭示DNA甲基化在塑造MB亞型特異性轉(zhuǎn)錄程序中的基礎(chǔ)作用。
（2）超級增強(qiáng)子DNA低甲基化與髓母細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)
研究團(tuán)隊系統(tǒng)解析了DMR在基因組元件中的分布特征。在四個亞型中，超級增強(qiáng)子（SE）區(qū)域均富集DMR，提示SE的表觀遺傳失調(diào)是MB的共同特征（圖1C）。通過配對樣本的甲基化和基因表達(dá)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)se區(qū)域的DMR（seDMRs）靶向基因與甲基化水平呈現(xiàn)最顯著負(fù)相關(guān)性，顯著強(qiáng)于啟動子DMR（pDMR）和基因體DMR（bDMR）（圖1D），尤其在G3-MB中的負(fù)調(diào)控最為顯著。研究團(tuán)隊將甲基化與表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)的seDMR定義為“功能seDMR”（F-seDMR）。值得注意的是，低甲基化F-seDMR（hypo-F-seDMR）靶向基因顯著富集于各亞型起源的小腦發(fā)育早期細(xì)胞類型標(biāo)記物：G3-MB中富集RLSVZ（菱唇亞腦室區(qū)）和早期UBC（單極刷細(xì)胞）標(biāo)記物，G4-MB中富集早期UBC和晚期UBC標(biāo)記物（圖1E）。這些F-seDMR靶向的胚胎小腦標(biāo)記物可有效區(qū)分G3和G4亞型。通路分析顯示，hypo-F-seDMR靶向基因富集于干性維持、WNT信號、TGF-β信號等腫瘤自我更新相關(guān)通路（圖1F）。上述結(jié)果表明，SE低甲基化通過維持發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄程序，將腫瘤細(xì)胞鎖定在祖細(xì)胞樣狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。
（3）祖細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞特異的SE低甲基化增加G3-MB染色質(zhì)可及性
為闡明SE低甲基化的功能，研究對G3-MB樣本進(jìn)行snATAC-seq以分析染色質(zhì)可及性（Chromatin Accessibility, CA）。發(fā)現(xiàn)約65%的功能性seDMRs（F-seDMRs）位于開放染色質(zhì)區(qū)域（圖2A），且低甲基化F-seDMRs的CA顯著高于高甲基化F-seDMRs（圖2B-C），表明低甲基化直接促進(jìn)染色質(zhì)開放。
通過snRNA-seq將腫瘤細(xì)胞分為祖細(xì)胞樣（prog-like）、周期樣（cycling）和分化神經(jīng)元樣（diff-like）群體。細(xì)胞類型特異性差異可及峰分析發(fā)現(xiàn)，祖細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞特異的開放染色質(zhì)區(qū)域（peaks）主要位于低甲基化的SEs內(nèi)（63%），而分化樣細(xì)胞的開放區(qū)域則更多位于高甲基化啟動子區(qū)（圖2D）。例如，Otx2 SE低甲基化與其在腫瘤起始階段（祖細(xì)胞樣細(xì)胞）的高染色質(zhì)可及性密切相關(guān)（圖2D-E）。上述研究結(jié)果將特定的表觀遺傳狀態(tài)（SE低甲基化）與特定的腫瘤細(xì)胞狀態(tài)（干性/祖細(xì)胞狀態(tài)）進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
（4）Otx2樞紐增強(qiáng)子低甲基化可作為預(yù)后指標(biāo)
研究進(jìn)一步利用snATAC-seq數(shù)據(jù)和eNET算法構(gòu)建了增強(qiáng)子-基因互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)Otx2、Olfm1和Ddx31等基因受“樞紐增強(qiáng)子”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，且這些樞紐增強(qiáng)子區(qū)域顯著富集低甲基化F-seDMRs（圖2G-H）。其中，Otx2增強(qiáng)子網(wǎng)絡(luò)尤為復(fù)雜，其核心區(qū)域（如E33）顯著低甲基化（圖2I）。臨床數(shù)據(jù)分析表明，Otx2 SE（E33）低甲基化與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。根據(jù)E33甲基化水平將G3-MB或G3/G4-MB患者分組，低甲基化組患者總生存期更短（圖2K-L）。多因素分析證實，E33低甲基化是不依賴于性別、年齡、轉(zhuǎn)移狀態(tài)和亞型的獨(dú)立預(yù)后因子（圖2M）。上述研究結(jié)果驗證了Otx2 SE低甲基化作為G3/4-MB的預(yù)后生物標(biāo)記物。
（5）OTX2正反饋自調(diào)控促進(jìn)G3-MB進(jìn)展
鑒于Otx2在G3-MB中的關(guān)鍵作用，研究探索其調(diào)控機(jī)制。ChIP-seq和Hi-C數(shù)據(jù)證實OTX2蛋白結(jié)合在其自身的SE（E33）上，且該區(qū)域與Otx2啟動子在空間上鄰近，形成染色質(zhì)環(huán)路（圖3A）。報告基因?qū)嶒灡砻?，含有OTX2結(jié)合位點的野生型E33片段能顯著增強(qiáng)Otx2啟動子活性，而突變該位點則活性缺失（圖3B-D），證明OTX2通過結(jié)合自身SE形成正反饋自激活環(huán)路。功能實驗顯示，破壞此環(huán)路（E33突變）能抑制細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)分化（圖3E-G），并在小鼠原位移植瘤模型中顯著抑制腫瘤生長、延長生存期（圖3H-J）。這確立了Otx2 E33正反饋自調(diào)控對維持G3-MB惡性表型的關(guān)鍵作用。
（6）OTX2招募TET3介導(dǎo)Otx2超級增強(qiáng)子去甲基化
接下來，研究人員深入探索了E33低甲基化的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子富集分析顯示OTX2在hypo-F-seDMR區(qū)域顯著富集（圖4A）。對去甲基化酶TET家族的分析發(fā)現(xiàn)，TET3在G3-MB中高表達(dá)，且其表達(dá)與Otx2表達(dá)正相關(guān)（圖4B）。在G3-MB中，TET3高表達(dá)亞組表現(xiàn)出更高的染色質(zhì)可及性（圖4C）。功能實驗證實敲低TET3會導(dǎo)致Otx2 SE區(qū)域甲基化水平升高，同時Otx2表達(dá)下降（圖4E-F），而過表達(dá)Otx2可逆轉(zhuǎn)TET3抑制增殖缺失，表明TET3通過調(diào)控Otx2 SE甲基化影響其表達(dá)。CUT&Tag-seq和ChIP-seq顯示TET3與OTX2在Otx2 SE區(qū)域共定位（圖4G-K），且TET3結(jié)合位點與OTX2結(jié)合位點顯著重疊（圖4L），這些重疊區(qū)域DNA甲基化顯著降低。ChIP-qPCR證實Tet3敲低顯著減少OTX2在E33的結(jié)合（圖4H）。Co-IP驗證OTX2與TET3物理互作，且E33突變可減少互作（圖4I-J）。TET3依賴的OTX2靶基因富集于干性、分化、細(xì)胞周期、炎癥和轉(zhuǎn)移相關(guān)通路（圖4M）。上述結(jié)果表明，OTX2通過招募TET3至其自身的SE區(qū)域，介導(dǎo)TET3進(jìn)行位點特異性去甲基化，從而放開染色質(zhì)、激活自身轉(zhuǎn)錄，形成“去甲基化-染色質(zhì)開放-OTX2表達(dá)上調(diào)”的正反饋環(huán)路。
（7）TET3下調(diào)在體內(nèi)抑制G3-MB進(jìn)展
基于上述機(jī)制，研究團(tuán)隊開發(fā)了靶向治療策略。構(gòu)建了負(fù)載TET3抑制劑Bobcat339或siTET3的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）系統(tǒng)，并證實其能有效遞送至腦腫瘤部位（圖5A-F）。在3D類器官和原位移植瘤（包括細(xì)胞系來源和PDX來源）模型中，LNP@Bobcat339或LNP@siTET3處理均能顯著抑制腫瘤細(xì)胞活力、減少腫瘤體積、延長小鼠生存期（圖5G-K）。治療后腫瘤組織增殖標(biāo)記物（Ki-67）下降，分化標(biāo)記物（NeuN）上升，侵襲標(biāo)記物（MMP9）減少（圖5J）。上述結(jié)果證明了靶向TET3-Otx2 SE軸作為G3-MB治療的可行性。
結(jié)論和啟示
本研究通過WGBS分子機(jī)制探索和多重實驗驗證揭示了Otx2 SE低甲基化是G3-MB的關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記物和預(yù)后因子。OTX2通過招募TET3對其自身SE進(jìn)行去甲基化，形成正反饋環(huán)路，驅(qū)動腫瘤干性和進(jìn)展。利用LNP遞送TET3抑制劑或siRNA能有效抑制腫瘤生長，為G3-MB提供了新的機(jī)制認(rèn)知、預(yù)后工具和極具轉(zhuǎn)化潛力的治療策略。
WGBS在本研究中的核心作用
本研究始于對189例MB樣本的WGBS分析，系統(tǒng)性地比較各亞型、各基因組區(qū)域的甲基化差異，從而將目光聚焦于此前容易被忽略的增強(qiáng)子區(qū)域，并精準(zhǔn)定位Otx2 SE這一關(guān)鍵調(diào)控元件的甲基化狀態(tài)，將其與預(yù)后、機(jī)制和治療靶點緊密相連，貫穿了從基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)到轉(zhuǎn)化研究的全過程。
參考文獻(xiàn)：Chen X,…et al.Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer. Cell Rep Med. 2025 Dec 2:102474.doi: 10.1016/j.xcrm.2025.102474.
