GUS應(yīng)用及原理
Gus基因存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，編碼β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS），該酶是一種水解酶，能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。因?yàn)榻^大多數(shù)植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，因此gus基因廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物的報(bào)告基因，尤其是在研究外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)有。此外，gus基因3’端與其他結(jié)構(gòu)形式的融合基因也能夠正常表達(dá)，所產(chǎn)生的融合蛋白仍具有GUS活性，這對研究外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞部位提供了方便條件，也是它相對于其他報(bào)告基因的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。 在適宜條件下，該酶可將X-Gluc水解生成藍(lán)色物質(zhì)，初始產(chǎn)物并不帶顏色，為無色的吲哚衍生物，后經(jīng)氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛藍(lán)染料，此靛藍(lán)染料使具有GUS活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，可用肉眼或在顯微鏡下觀察到。一般用來顯示某基因的組織表達(dá)模式。
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GUS染液配制
我們使用的是翊圣公司的X-Gluc，下面的protocol也是翊圣公司的。
| 試劑（母液濃度） | 體積（1 ml ） | 終濃度 |
|---|---|---|
| ddH2O | 830 μl | - |
| 1 M 磷酸鈉（pH7.0） | 100 μl | 0.1 M |
| 0.5 M EDTA, pH8.0 | 20 μl | 10 mM |
| 10% Triton X-100 | 10 μl | 0.1 (v/v) |
| 50 mM 鐵氰化鉀 | 20 μl | 1 mM |
| 0.1M X-Gluc(50 mg/ml ) in DMF | 20 μl | 2 mM |
以上這些試劑除了EDTA，其他試劑配制比較簡單。下面是這些試劑配制的具體方法：
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1 M 磷酸鈉
需要稱取磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉各6.659 g和1.778 g，加入25 ml 左右的ddH2O，最后定容到30 ml ，基本上混合均勻完全溶解即可達(dá)到pH7.0左右，無需調(diào)pH。
注意：兩者混合后一開始可能無法全溶解，需要過個(gè)幾分鐘才可以溶解。
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0.5 M EDTA
我們用的就是Na鹽，稱取5.584 g，加入20 ml ddH2O，此時(shí)看到的是白色沉淀，無法溶解（只有在pH8.0左右的時(shí)候，EDTA才能夠完全溶解于水中），然后加入0.5 g片狀NaOH，此時(shí)pH可能還沒有到達(dá)8.0，然后用9 M的NaOH溶液進(jìn)行緩慢pH調(diào)整，觀察溶液是否澄清。澄清時(shí)測定pH，調(diào)整直到8.0，最后定容到30 ml 。
當(dāng)EDTA全部溶解的時(shí)候，pH值大概就在8.0左右。
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10% Triton X-100
取0.5 ml Triton X-100，加入到4.5 ml的ddH2O中，使其充分溶解，但是因?yàn)槭潜砻婊钚詣赡軙?huì)出現(xiàn)較多的泡沫，靜置一段時(shí)間后，自然會(huì)消失。
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50 mM K3Fe(CN)6
稱取0.165 g，加入8 ml的ddH2O，溶解后定容至10 ml。最后溶液的顏色是淡黃色的。
三價(jià)鐵容易被還原，因此需要將其避光保存，一旦發(fā)現(xiàn)顏色發(fā)生了變化，那么就需要重新配制。
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50 mg/ml X-Gluc
1 ml DMF溶解50 mg的X-Gluc粉末，濃度就是50 mg/ml。一般都是現(xiàn)配現(xiàn)用，需要多少用多少。一個(gè)樣品染色，需要500 μl。根據(jù)樣品的多少來稱取粉末的量，不要太浪費(fèi)。
染色
取上一步配制好的GUS染液，將你的樣品加入其中，然后用錫箔紙包起來，放置于37℃，12h-16h左右，就可以看到靛藍(lán)色。染色具體時(shí)間依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而定，可靈活變動(dòng)。
顯微成像
使用顯微鏡進(jìn)行染色結(jié)果的記錄，拍照可以調(diào)整幾個(gè)參數(shù)，曝光值，自動(dòng)白平衡，基本就這兩個(gè)參數(shù)，盡量將背景拍得明亮一些，顯得干凈。拍攝之后要記得添加標(biāo)尺scale，一般需要調(diào)整為一致的標(biāo)尺。
