前言
基因測序已是時下熱門，目前除了華大基因之外，其他分布于全中國的大型測序平臺（HiSeq X 10）還有約10個，每個每年大概能完成1.8萬人的高深度全基因組測序，加起來就是18萬人，如果加上華大，可能需要翻倍！而且隨著新技術(shù)的快速發(fā)展和成本的下降，WGS正變得越來越普遍！再加上國家十三五規(guī)劃已經(jīng)提出了構(gòu)建大規(guī)模中國人群遺傳隊列圖譜的要求，全基因組測序技術(shù)正在逐漸替代其它測序手段，這也是我打算寫這一個系列的原因。
HiSeq X 10分布（來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學網(wǎng)）
首先，全基因組測序的英文是Whole Genome Sequencing，簡稱WGS，目前默認指的是人類的全基因組測序。所謂全（Whole），指的就是 把物種細胞里面完整的基因組序列從第1個DNA開始一直到最后一個DNA，完完整整地檢測出來，并排列好，因此這個技術(shù)幾乎能夠鑒定出基因組上任何類型的突變。對于人類來說，全基因組測序的價值是極大的，它的信息包含了所有基因和生命特征之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，當然也意味著更大的數(shù)據(jù)解讀和更高的技術(shù)挑戰(zhàn)。但，沒關(guān)系，在這個系列中，我將從測序技術(shù)、常用文件解析，數(shù)據(jù)質(zhì)控和流程構(gòu)建等各個方面結(jié)合實際的例子，詳細闡述什么是全基因組測序以及 該如何構(gòu)造流程分析全基因組測序（WGS）數(shù)據(jù)。
這是這一組學入門技術(shù)系列的第一篇（這篇文章修改自我以前的一篇博客，該文也已被各種形式轉(zhuǎn)載），我首先將介紹當前的基因組測序原理及其發(fā)展歷程。
第一節(jié) NGS測序技術(shù)
在真正開始數(shù)據(jù)分析之前先知道我們是如何將那些原本存在于細胞中的DNA信息獲取出來的——也就是測序的原理，總是有益的。
測序，簡單來說就是將DNA化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)橛嬎銠C可處理的數(shù)字信號。
它從1977年的第一代Sanger技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)足有40年時間。在這個技術(shù)發(fā)展的更迭歷程中，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當前形勢看第二代短讀長測序技術(shù)在全球范圍內(nèi)上占有著絕對的壟斷位置，但第三測序技術(shù)也已在這幾年快速地發(fā)展著。測序技術(shù)的每一次變革和突破，都對基因組學研究，疾病醫(yī)療研究，藥物研發(fā)，育種等領域產(chǎn)生巨大的推動作用。所以在這個系列的第一篇里我將對當前最主流的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個全面的介紹。
圖1. 測序技術(shù)發(fā)展歷程
第一代測序技術(shù)
第一代DNA測序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學法（鏈降解）. 并在1977年，由桑格老人家測定了第一個基因組序列——噬菌體phiX-174，全長只有5,375個堿基。雖然與今日的技術(shù)比起來根本不算什么，但自此之后，人類獲得了窺探生命本質(zhì)的能力，并以此為開端真正步入了基因組學時代。
研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷對其進行改進。在2001年，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為基礎進行測序的。Sanger法的核心原理是：由于ddNTP（4種帶有熒光標記的A,C,G,T堿基）的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA的合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分別為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），然后利用凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列（圖2）。這個網(wǎng)址為Sanger測序法制作了一個小短片，形象而生動。
值得注意的是，在測序技術(shù)起步發(fā)展的這一時期中，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)，如焦磷酸測序法、連接酶法等。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID使用的測序方法，但他們的核心手段都是利用了Sanger中可中斷DNA合成反應的dNTP。
圖2. Sanger測序發(fā)原理
第二代測序技術(shù)
總的來說，第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達1,000bp，準確性高達99.999%，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規(guī)模的應用。因而第一代測序技術(shù)并不是理想的測序方法。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa/HiSeq技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)為標記的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代測序技術(shù)在大幅提高了測序速度的同時，還大大地降低了測序成本，并且保持了高準確性，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術(shù)則僅僅需要1周，但其序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多，大多只有100bp-150bp。圖3. 是第一代和第二代測序技術(shù)測序成本作了一個簡單的比較，可以看出自第二代測序技術(shù)發(fā)展出來之后，歷史開始發(fā)生根本性的改變，測序的成本開始快速實現(xiàn)斷崖式下降，也就是業(yè)內(nèi)經(jīng)常提到的 超摩爾定律 現(xiàn)象。
圖3. 測序成本比較（來源：NIH網(wǎng)站）
接下來我以illumina（目前最大、最成功的NGS測序儀公司）的技術(shù)為基礎簡要單介紹第二代測序測序技術(shù)的原理和特點。
目前illumina的測序儀占全球75%以上，以HiSeq系列為主。它的機器采用的都是邊合成邊測序的方法，主要分為以下4個步驟：
圖4. illumina測序原理（來源：illumina官網(wǎng)）
1）構(gòu)建DNA測序文庫，圖4-1
簡單來說就是把一堆亂糟糟的DNA分子用超聲波打斷成一定長度范圍的小片段。目前除了一些特殊的需求之外，基本都是打斷為300bp-800bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭【注】，構(gòu)建出單鏈DNA文庫，以備測序之用；
【注】接頭在illumina中一般分為P5和P7接頭，其中一個帶有和flowcell上的探針反向互補的序列，以完成待測序列和探針結(jié)合的作用，另外一個接頭帶有barcord序列以區(qū)分不同的樣本。
2）測序流動槽（flowcell），圖4-2
flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，也是核心的測序反應容器——所有的測序過程就發(fā)生在這里。當文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的槽道（稱為lane）上。每個flowcell有8個lane（圖5），每個lane的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對，這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因，并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增，理論上這些lane之間是不會相互影響的。
[圖片上傳失敗...(image-a0a013-1645003235293)]
圖5. flowcell（實物 VS 示意圖）
3）橋式PCR擴增與變性
圖6. 橋式PCR擴增（來源：illumina官網(wǎng)）
這是NGS技術(shù)的一個核心特點。橋式PCR以flowcell表面所固定的序列為模板，進行橋形擴增，如圖6所示。經(jīng)過不斷的擴增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝，這一過程的目的在于實現(xiàn)將單一堿基的信號強度進行放大，以達到測序所需的信號要求。
4）測序，如圖4-4和圖7所示
圖7. 邊合成邊測序（來源：illumina官網(wǎng)）
測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP，這就確保了在測序過程中，一次只會被添加一個堿基。同時在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號（圖7），并有光學設備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應。
Illumina的這種每次只添加一個dNTP的技術(shù)特點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%左右。測序周期以人類基因組重測序為例，30x-50x測序深度對于Hisq系列需要3-5天時間，而對于2017年初最新推出的NovaSeq系列則只需要40個小時！
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表1. 測序量比較（雙流動槽為例，如為單流動槽則測序量減少為下表的一半，時間不變）
一次測序的數(shù)據(jù)總產(chǎn)量的單位Gb，不是計算機字節(jié)，而是測序堿基的數(shù)目（Giga base）
圖8. NovaSeq與其他測序儀測序通量的比較（來源：illumina官網(wǎng)）
上面表1和圖8是NovaSeq和其他測序系列的比較，數(shù)據(jù)相當好。按照這個數(shù)據(jù)量估算，一臺NovaSeq 6000（S4）在跑滿的情況下，一年就可以測序6400多人！而且按照以往的經(jīng)驗，illumina的官方公布的數(shù)據(jù)都是偏于保守的，我們在實際的使用過程中發(fā)現(xiàn) 高質(zhì)量（Q30）的read其實占到了總數(shù)據(jù)的90%以上，遠高于官方公布的75%，數(shù)據(jù)的總產(chǎn)量也同樣更高。
第三代測序技術(shù)
這是一個新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術(shù)為標志，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比，最大的特點就是 單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，超長讀長，以下圖9是PacBio SMRT技術(shù)的測序讀長分布情況，平均達到10Kb-15Kb，是二代測序技術(shù)的100倍以上，值得注意的是在測序過程中這些序列的讀長也不再是相等的，下文有解析！
圖9. PacBio SMRT 測序read讀長分布（來源：PacBio官網(wǎng)）
PacBio SMRT
PacBio SMRT技術(shù)其實也應用了邊合成邊測序的思想，并以SMRT芯片為測序載體（如同flowcell）?；驹硎牵?DNA聚合酶和模板結(jié)合，用4色熒光標記A,C,G,T這4種堿基（即是dNTP）。在堿基的配對階段，不同的堿基加入，會發(fā)出不同的光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。
圖10. PacBio SMRT 測序原理
這個DNA聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一，讀長主要跟酶的活性保持有關(guān)，它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個關(guān)鍵點是在于如何將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。這些小孔的直徑是有嚴格要求的，如果直徑大于微波波長，能量就會在衍射效應的作用下穿透面板從而泄露出來（光波的衍射效應），從而與周圍小孔相互干擾（光波的干涉）。如果孔徑能夠小于波長，那么能量就不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)，從而可起到保護的作用。同理，在一個反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多這樣的圓形納米小孔,，即 ZMW(零模波導孔)，外徑100多納米，比檢測激光波長小(數(shù)百納米)，激光從底部打上去后不會穿透小孔進入上方的溶液區(qū)，能量會被限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里（圖10-A），正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅僅只是來自于這個小反應區(qū)域，孔外過多的游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實現(xiàn)將背景噪音降到最低的目的。
PacBio SMRT技術(shù)除了能夠檢測普通的堿基之外，還可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測堿基的表觀修飾情況，如甲基化。因為假設某個堿基存在表觀修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，那么相鄰兩峰之間的距離會增大，我們可以通過這個時間上的差異來檢測表觀甲基化修飾等信息（圖11）。
圖11. PacBio SMRT 檢測甲基化修飾（來源：PacBio官網(wǎng)）
SMRT技術(shù)的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但這么快的測序速度也帶來了一些明顯的缺點——測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通?。?，可以達到10%-15%，而且以缺失序列和錯位居多，但好在它的出錯是隨機的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在一定的堿基偏向，因此可以通過多次測序來進行有效糾錯。
Oxford Nanopore
Oxford Nanopore 的MinION是另一個比較受關(guān)注的第三代測序儀，俗稱U盤測序儀，它真的很小，我親手拿過，并拆過，圖12（左）！這家公司開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)相比都不一樣，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)！
圖12. Oxford Nanopore MinION
這個技術(shù)的關(guān)鍵點在于他們所設計的一種特殊納米孔，孔內(nèi)共價結(jié)合分子接頭。當DNA分子通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），最后高靈敏度的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖13）。
圖13. MinION 測序原理
納米孔測序以及其他第三代測序技術(shù)，有可能會徹底地解決目前第二代測序平臺的諸多不足。另外，MinION的主要特點是：讀長很長，而且比PacBio的都長得多，基本都是在幾十kb上百kb以上，最新的數(shù)據(jù)顯示可以達到900 kb！錯誤率是5%-15%，也是隨機錯誤，MinION最大的特點除了極小的體積之外，就是數(shù)據(jù)將是可實時讀取的，并且起始DNA在測序過程中不被破壞！這真是個可以上天的能力。然鵝，遺憾地多說幾句，目前還沒真正公布，細節(jié)也不知，自從2012開過一次發(fā)布會之后，就沒什么聲響了。
這種納米孔單分子測序儀還有另一大特點，它能夠 直接 讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代測序方法那樣需要事先對基因組進行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助。下面是對PacBio和Oxford Nanopore這兩家第三代測序技術(shù)公司的測序儀做的一個簡單比較，可以看出其實成本還是蠻高的，質(zhì)量也只是還行，期待他們的下一次進化吧。
總結(jié)
以上，便是對各代測序技術(shù)的原理做了簡要的闡述。在這個比較的過程中，可以看到測序成本，讀長和通量是該測序技術(shù)先進與否的三個重要指標。其實第一代和第二代測序技術(shù)除了通量和成本上的差異之外，測序的核心原理都來自于邊合成邊測序的思想。第二代測序技術(shù)的優(yōu)點是通量大大提升，成本大大減低，使得昔日王榭堂前燕，可以飛入尋常百姓家?？傊?，只有變成白菜價，才能真正對大眾有意義；但它的缺點是所引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率，并且具有系統(tǒng)偏向性，同時讀長也比較短。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點而開發(fā)的，它的根本特點是單分子測序，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效避免因PCR偏向性而導致的系統(tǒng)錯誤，同時提高讀長，但這個技術(shù)還不是很成熟，需要再進化，成本也偏高。
圖14. 全球測序儀數(shù)量分布
參考文獻
- Sanger, F. & Nicklen, S. DNA sequencing with chain-terminating. 74, 5463–5467 (1977).
- Mardis, E. R. Next-generation DNA sequencing methods. Annual review of genomics and human genetics 9, 387–402 (2008).
- Shendure, J. & Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology 26, 1135–45 (2008).
- Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics 11, 31–46 (2010).
- Niedringhaus, T. P., Milanova, D., Kerby, M. B., Snyder, M. P. & Barron, A. E. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies. 4327–4341 (2011).
- Rothberg, J. M. et al. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature 475, 348–52 (2011).
原文：從零開始完整學習全基因組測序（WGS）數(shù)據(jù)分析：第1節(jié) 測序技術(shù) | Public Library of Bioinformatics (plob.org)
