該綜述發(fā)表在Chemical Reviews雜志上，影響因子高達(dá)54.301分，對(duì)細(xì)胞外囊泡的研究方法總結(jié)非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，這篇綜述都有介紹，十分詳盡！通訊作者是哈佛大學(xué)的Hakho Lee教授。
Extracellular Vesicles (EVs) 細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞主動(dòng)釋放的多樣的納米級(jí)膜囊泡。類似大小的囊泡可根據(jù)其生物發(fā)生、大小和生物物理性質(zhì)進(jìn)一步分類(如外泌體、微囊泡)。雖然EVs最初被認(rèn)為是細(xì)胞碎片，因此未被重視，但現(xiàn)在EVs越來越多地被認(rèn)為是細(xì)胞間通信和疾病診斷和預(yù)后的循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體。
該綜述的內(nèi)容包含：
- Introduction
- EV的形成、內(nèi)含物
- 物理特征（電鏡、納米顆粒分析等）
- EV的富集方法（分為傳統(tǒng)的高通量方法，如超速離心、密度梯度離心、沉淀法、分子排阻法、場(chǎng)流分級(jí)法；新方法，如微流控法、非接觸法、免疫吸附法）
- EV蛋白的分析（首先分膜蛋白和內(nèi)部蛋白；然后介紹分析方法，傳統(tǒng)法包括WB、ELISA、質(zhì)譜等，新方法包括小顆粒流式等）
- EV核酸分析（分mRNA、miRNA和其他RNA、DNA分析等）
- EVs的臨床應(yīng)用（主要介紹了其在癌癥的診斷應(yīng)用，如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等；神經(jīng)退行性疾病和急性器官損傷；及其治療上的潛力）
- 總結(jié)和展望
1. INTRODUCTION
生物流體（Biofluids）中含有大量的EVs，這些EVs可以從Parental Cells轉(zhuǎn)移不同的分子去其他細(xì)胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。
2. EV BIOGENESIS AND CONTENTS
根據(jù)其生物起源，EVs主要分為三大類：外泌體、微囊泡和凋亡小體。本文側(cè)重前兩類，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生于活細(xì)胞。
2.1 Vesicle Formation
EV的細(xì)胞釋放是通過質(zhì)膜的向外出芽（微囊泡途徑）或通過內(nèi)體膜的內(nèi)向出芽（外泌體途徑）發(fā)生的。 外泌體是內(nèi)吞起源的囊泡。 質(zhì)膜向內(nèi)侵入形成早期的內(nèi)體后，內(nèi)體[現(xiàn)在稱為多囊體(MVB)]限制膜進(jìn)一步向內(nèi)萌芽，形成為腔內(nèi)囊泡。最后，外泌體通過MVB與質(zhì)膜的融合被分泌。
質(zhì)膜雙層具有不對(duì)稱的磷脂分布。 分布受三種主要蛋白質(zhì)控制：內(nèi)向泵，對(duì)磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺具有特異性的脂肪酶； 外向泵，一種絮凝酶； 脂質(zhì)加擾酶，可促進(jìn)脂質(zhì)在雙層中的雙向重新分布。 細(xì)胞刺激后，脂質(zhì)重新分布，導(dǎo)致微囊形成和釋放。
2.2 EV Molecular Contents
EV的形成決定了其膜組成。
微小囊泡的膜組成最能反映其Parental Cells(母細(xì)胞)的質(zhì)膜。
相反，外泌體中已經(jīng)鑒定出特異性的內(nèi)體蛋白分子，這反映出外泌體形成的機(jī)制。內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）已被廣泛認(rèn)為用于調(diào)節(jié)和引導(dǎo)特定分子進(jìn)入MVB的腔內(nèi)囊泡。ESCRT及其四個(gè)主要復(fù)合物（ESCRT 0，I，II和III）負(fù)責(zé)傳遞泛素化蛋白，用于溶酶體降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改變外泌體的蛋白質(zhì)含量和細(xì)胞釋放外泌體的速率。更有趣的是，發(fā)現(xiàn)外泌體富含ESCRT系統(tǒng)的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌體識(shí)別的標(biāo)記。
ESCRT不是介導(dǎo)外泌體形成的唯一機(jī)制。其他不依賴ESCRT的過程似乎也能以相互交織的方式參與其形成和分泌。外泌體也富含ESCRT非依賴性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被證明參與內(nèi)體小泡運(yùn)輸。小GTP酶的Rab家族參與小泡運(yùn)輸和與質(zhì)膜融合表明這些蛋白在釋放外泌體中的作用。另外，外泌體中神經(jīng)酰胺水平升高，抑制鞘磷脂會(huì)引起的外泌體釋放減少，表明鞘磷脂酶與囊泡釋放有關(guān)。
外泌體和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非編碼RNA。自從最初發(fā)現(xiàn)EV含有RNA，人們一直非常關(guān)注EV RNA用作診斷生物標(biāo)志物。在開創(chuàng)性的工作中，Skog等人發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的血清外泌體含有特征性的突變mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供診斷信息。這些核酸的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了這樣的假設(shè)，即EVs可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移遺傳信息。確實(shí)，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主細(xì)胞后仍然可以翻譯的mRNA。EV中也有逆轉(zhuǎn)座子和其他非編碼RNA的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列和miRNA以及可翻譯的mRNA都通過EV進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這些成果突出了EVs作為遺傳信息的載體和傳播者的重要性。
3. PHYSICAL CHARACTERIZATION
3.1 Microscopy-Based Methods
雖然傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡的衍射極限接近EV的大小，但是不能產(chǎn)生清晰的圖像。高分辨率EV圖像需要通過電子顯微鏡(EM)或原子力顯微鏡(AFM)得到。然而，這些方法的通量有限，因?yàn)樾枰獙ｉT的染色方案和設(shè)備。
3.1.1. Scanning Electron Microscopy. 掃描電子顯微鏡
（a）掃描電子顯微鏡（SEM）提供三維的表面拓?fù)湫畔ⅰ?/p>
3.1.2 Transmission Electron Microscopy. 透射電子顯微鏡
（b）透射電子顯微鏡（TEM）具有出色的圖像分辨率，可結(jié)合免疫金標(biāo)記一起使用來提供分子表征。
3.1.3. Cryo-Electron Microscopy. 冷凍電鏡
（c）冷凍電鏡（cryo-EM）無需大量處理即可分析EV形態(tài)。
3.1.4. Atomic Force Microscopy. 原子力顯微鏡
（d）原子力顯微鏡（AFM）可以提供表面拓?fù)湫畔⒑臀h(huán)境的特性（例如剛度，附著力）。
3.2. Dynamic Light Scattering
動(dòng)態(tài)光散射(DLS)，也稱作光子相關(guān)光譜或準(zhǔn)彈性光散射，是一種物理表征手段，用來測(cè)量溶液或懸浮液中的粒徑分布，也可以用來測(cè)量如高分子濃溶液等復(fù)雜流體的行為。當(dāng)光射到遠(yuǎn)小于其波長(zhǎng)的小顆粒上時(shí)，光會(huì)向各方向散射（瑞利散射）。如果光源是激光，在某一方向上，我們可以觀察到散射光的強(qiáng)度隨時(shí)間而波動(dòng)，這是因?yàn)槿芤褐械奈⑿☆w粒在做布朗運(yùn)動(dòng)，且每個(gè)發(fā)生散射的顆粒之間的距離一直隨時(shí)間變化。來自不同顆粒的散射光因相位不同產(chǎn)生建設(shè)性或破壞性干涉。所得到的強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)的曲線帶有引起散射的顆粒隨時(shí)間移動(dòng)的資訊。動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)易受灰塵或雜質(zhì)影響，故樣品的過濾和離心十分重要。
動(dòng)態(tài)光散射用于表征蛋白質(zhì)、高分子、膠束、糖和納米顆粒的尺寸。如果系統(tǒng)是單分散的，顆粒的平均有效直徑可以求出來，這一測(cè)量取決于顆粒的心，表面結(jié)構(gòu)，顆粒的濃度和介質(zhì)中的離子種類。DLS也可以用于穩(wěn)定性研究，通過測(cè)量不同時(shí)間的粒徑分布，可以展現(xiàn)顆粒隨時(shí)間聚沉的趨勢(shì)。隨著微粒的聚沉，具有較大粒徑的顆粒變多。同樣，DLS也可以用來分析溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響。
動(dòng)態(tài)光散射是收集溶液中做布朗運(yùn)動(dòng)的顆粒散射光強(qiáng)度起伏的變化，通過相關(guān)器將光強(qiáng)的波動(dòng)轉(zhuǎn)化為相關(guān)曲線，從而得到光強(qiáng)波動(dòng)的速度，計(jì)算出粒子的擴(kuò)散速度信息和粒子的粒徑。小顆粒樣品的布朗運(yùn)動(dòng)速度快，光強(qiáng)波動(dòng)較快，相關(guān)曲線衰減較快，大顆粒反之。
在外泌體研究中，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量敏感度較高，測(cè)量下限為10納米。相對(duì)于SEM技術(shù)來說，樣品制備簡(jiǎn)單，只需要簡(jiǎn)單的過濾，測(cè)量速度較快。但是動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)由于是測(cè)量光強(qiáng)的波動(dòng)數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號(hào)會(huì)掩蓋較小顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號(hào)，所以動(dòng)態(tài)光散射不適合大小不一的復(fù)雜外泌體樣本的測(cè)量，只適合通過色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測(cè)量，并且無法測(cè)量樣品中外泌體的濃度。
3.3. Nanoparticle Tracking Analysis
納米粒子跟蹤分析(NTA)是一種光學(xué)粒子跟蹤方法，用于確定粒子的濃度和大小分布。用光束照射樣品中的粒子。當(dāng)粒子散射光并經(jīng)歷布朗運(yùn)動(dòng)時(shí)，攝像機(jī)記錄下每個(gè)粒子的路徑以確定平均速度和擴(kuò)散率。與DLS的體散射測(cè)量不同，NTA跟蹤單個(gè)粒子的散射。
然后，此信息將用于數(shù)學(xué)計(jì)算濃度（即視野中的粒子數(shù)量）和尺寸分布（即通過Strokes-Einstein方程的流體動(dòng)力學(xué)直徑，圖5b）。 為了準(zhǔn)確定量異質(zhì)囊泡的濃度和大小，NTA程序需要精確優(yōu)化攝像頭和分析設(shè)置。 可能需要使用不同設(shè)置進(jìn)行單獨(dú)測(cè)量，以獲取異質(zhì)混合物中EV子集的準(zhǔn)確讀數(shù)。
3.4. Tunable Resistive Pulse Sensing
可調(diào)電阻式脈沖傳感(TRPS)可以替代NTA，用于測(cè)量EV濃度和尺寸分布。該技術(shù)基于納米級(jí)的庫(kù)爾特原理。它檢測(cè)離子流的瞬態(tài)變化，該瞬變是由囊泡通過聚氨酯膜中尺寸可調(diào)的納米孔的傳輸而產(chǎn)生的。最近，Akers等人的直徑NTA始終比TRPS檢測(cè)到更多的EV。 對(duì)于較大的EV（> 150 nm），情況恰恰相反。這種差異表明感知機(jī)制上的差異，并表明需要協(xié)同多平臺(tái)去闡述EV特性。
3.5. Single EV Analysis (SEA) Method
在最近的一篇論文中，描述了一種光顯微鏡下的單一EV分析(SEA)技術(shù)，該技術(shù)能夠在單個(gè)囊泡中進(jìn)行穩(wěn)健的、多組分的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物測(cè)量。在這種方法中，EVs被固定在微流控腔內(nèi)，免疫染色并成像。當(dāng)小泡固定在晶片表面時(shí)，每個(gè)小泡的信噪比通常比溶液中或流動(dòng)狀態(tài)下的小泡的信噪比高得多。作者進(jìn)一步調(diào)整了以前用于多重循環(huán)細(xì)胞和組織分析的圖像循環(huán)過程，以補(bǔ)足EV的納米級(jí)尺寸。具體來說，作者使用衍生自三種同基因多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞系的EV， EV一次染色三個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)記，然后進(jìn)行四輪循環(huán)成像。結(jié)果表明，EVs生物標(biāo)志物的異質(zhì)性很高。然后使用t分布隨機(jī)鄰居嵌入（tSNE）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化； 無監(jiān)督聚類揭示了潛在的EV亞群的存在。SEA技術(shù)可能是研究各種EV類型的強(qiáng)大工具，可提供有關(guān)生物標(biāo)志物表達(dá)異質(zhì)性，標(biāo)記組成和鑒定EV亞群的豐富數(shù)據(jù)集。
4. EV ENRICHMENT
EVs在大小、起源和分子組成上都是異質(zhì)性的；除此之外，它們還存在于不同的復(fù)雜的生物流體中，包括血、胸腔積液、腹水、乳汁、唾液、腦脊液和尿液。這些流體中還含有大量的非囊泡大分子結(jié)構(gòu)，可能會(huì)干擾EV的分析。所以EV的分離和富集顯得尤為重要。
4.1. High-Throughput Bulk Methods
超速離心法（80%）和密度梯度離心法（20%）是最常見的兩種高通量混合分離法。根據(jù)它們分離機(jī)制，這些方法可以分為三大類:密度、親和和大小。
4.1.1. Ultracentrifugation.
用不同的離心力將顆粒分離:以較低的離心力(300g)去除細(xì)胞碎片，而以較高的離心力(100000g)對(duì)EV進(jìn)行沉淀和濃縮。盡管該方法是應(yīng)用最廣泛的金標(biāo)準(zhǔn)，但它也有許多缺點(diǎn)，如體積大、儀器昂貴、處理時(shí)間長(zhǎng)、過程繁瑣、被聚集的蛋白質(zhì)和核蛋白顆粒污染以及需要大量的樣品。
4.1.2. Gradient Ultracentrifugation
蔗糖梯度離心法是一種更為嚴(yán)格的超速離心法，它有助于進(jìn)一步分離不同密度的囊泡，通常用于分離外泌體(懸浮密度為1.15至1.19 g/mL)。在這種方法中，一個(gè)包含不同大小囊泡和大分子的樣品在一個(gè)密度從上到下遞增的梯度表面上被分層。在離心過程中，不同的分子以不同的速率通過梯度沉積。由于其分辨率更高，該方法被認(rèn)為可以分離更高純度的EVs(特別是外泌體)；然而，它面臨著許多與超速離心法相關(guān)的限制。更加新的等滲梯度(如碘黃醇梯度)法被認(rèn)為效果更好。
4.1.3. Co-Precipitation
最近，基于聚合物共沉淀法的商業(yè)試劑盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被開發(fā)用于EV富集。這些試劑采用降低EV的水合作用(從而降低溶解度)導(dǎo)致沉淀，然后在低離心力的情況下，沉淀的EV產(chǎn)物可以很容易地、重復(fù)性地分離出來，從而避免了長(zhǎng)時(shí)間的超速離心法操作。然而，這些試劑盒對(duì)于大規(guī)模使用來說是昂貴的，而且對(duì)于EV來說缺乏特異性。該方法還容易產(chǎn)生非均相聚合物顆粒。由于這些試劑均降低了EV和蛋白質(zhì)的溶解度，因此該方法還可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA復(fù)合物。因此，共沉淀法作為EV分離方法受到了限制。
4.1.4. Size-Exclusion Chromatography
大小排阻色譜法根據(jù)它們的分子大小通過凝膠過濾來分離囊泡和其他分子。這種凝膠由含有特定大小分布孔隙的球形珠組成。當(dāng)樣品進(jìn)入凝膠時(shí)，小分子擴(kuò)散到孔隙中，而大分子則直接洗脫。因此，大分子比小分子更早地離開色譜柱，這使得分子的停留時(shí)間與色譜柱的大小相關(guān)聯(lián)成為可能。近年來，該分離方法已被應(yīng)用于從復(fù)雜的生物媒介中分離純化囊泡。Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon等商業(yè)公司也正在開發(fā)商業(yè)的產(chǎn)品以簡(jiǎn)化EV富集，這些產(chǎn)品的排除柱都大約是75納米孔徑的樹脂。蛋白質(zhì)和其他較小的污染分子被滯留在孔徑中，而較大的囊泡(>75 nm)可以迅速通過并在空隙中被洗脫。大小排阻法可將EV與可溶性蛋白分離；為提高分離的效率和分辨率，需要考慮多種因素，包括介質(zhì)類型、孔徑、EV與介質(zhì)之間的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。
4.1.5. Field Flow Fractionation
場(chǎng)流分餾是另一種分離技術(shù)，該技術(shù)垂直于樣品流施加一個(gè)力場(chǎng)，使不同大小和分子量的分離成為可能。近年來，一種非對(duì)稱流場(chǎng)流分餾技術(shù)(AF4)被應(yīng)用于EV的分離。AF4在通道邊界處有一個(gè)可滲透板塊。當(dāng)樣品在通道中流動(dòng)時(shí)，由于層流流動(dòng)，流體在邊界處的速度比在中心處的速度慢，所以形成了拋物線速度剖面。當(dāng)施加垂直力場(chǎng)時(shí)，樣品中的分析物被推向邊界。布朗運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生一種抵消運(yùn)動(dòng)，使較小的粒子趨向于離邊界更遠(yuǎn)的平衡位置。這種類型的分離范圍廣，適用于各種洗脫液。
4.2. New Enrichment Methods
為了提高復(fù)雜生物流體的EV分離效率和特異性，人們開發(fā)了多種新的EV富集方法。然而，與傳統(tǒng)方法相比，這些新方法中的大多數(shù)具有較低的吞吐率，應(yīng)加以解決使之變得實(shí)用。
4.2.1. Microfluidic Filtering
基于分子大小的分離是一種很有潛力的方法，可以將EV與大型細(xì)胞碎片分離開來。各種微流體過濾系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)出來，用于從大的細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)聚集物中分離EV，這些系統(tǒng)大部分是基于分子大小差異。例如,Rho等人構(gòu)建了一種微流控設(shè)備，該設(shè)備使用膜過濾器對(duì)未處理的血液樣本進(jìn)行篩選，來分離EV。膜過濾器的大小～1μm。在膜的下方插入一個(gè)毛細(xì)管，用于引導(dǎo)過濾后的EV進(jìn)入收集通道。膜過濾器和毛細(xì)管導(dǎo)向器夾在兩個(gè)環(huán)形磁鐵之間；這種設(shè)置在進(jìn)行大量的樣品處理時(shí)可以方便地更換過濾器集。
4.2.2. Contact-Free Sorting
Lee等人最近使用聲波以無接觸方式對(duì)EV進(jìn)行細(xì)分。這種分離利用超聲波駐波，根據(jù)囊泡的大小和密度對(duì)其施加不同的聲交互作用力。該裝置由一對(duì)相互交錯(cuò)的換能器(IDT)電極組成，用以產(chǎn)生跨流動(dòng)通道的駐波表面聲波。
4.2.3. Immunoaffinity Enrichment
免疫親和捕獲的簡(jiǎn)便性使其成為一種有吸引力的方法。在這種方法中，利用常見EV標(biāo)記物（包括四跨膜蛋白（例如，CD9，CD63和CD81）以及與腫瘤相關(guān)的標(biāo)記物（例如，EGFR和EpCAM））的特異性抗體捕獲EV。目前已經(jīng)有各種微流體裝置以用于EV的選擇性分離。趙等，最近開發(fā)了一種微流體ExoSearch芯片，該芯片可使用免疫磁珠持續(xù)混合和分離EV。芯片由一個(gè)Y形注射器和一個(gè)蛇形流體混合器組成，用于孵育和免疫磁珠結(jié)合EV。然后可以將結(jié)合有EV的磁珠通過磁力保留為緊密的聚集體，用于下游光學(xué)檢測(cè)。該方法可輕松應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)控環(huán)境中進(jìn)行小規(guī)模富集。但是，這些方法主要取決于標(biāo)記，因此往往會(huì)低估計(jì)數(shù)?？贵w-抗原結(jié)合的強(qiáng)大親和力也使分離捕獲的EV進(jìn)行后續(xù)功能分析變得頗具挑戰(zhàn)性。
5. EV PROTEIN ANALYSIS
5.1. Proteins Enriched in EVs
EV蛋白主要來源于胞質(zhì)膜、胞質(zhì)醇，而非其他胞內(nèi)細(xì)胞器(如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等)。EV蛋白質(zhì)的構(gòu)成提示了囊泡的生物發(fā)生和cargo sorting(這個(gè)翻譯有點(diǎn)怪)。因此國(guó)際細(xì)胞外囊泡組織建議應(yīng)該仔細(xì)鑒定EV蛋白，特別是跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白。
5.1.1. Membrane Proteins.
在哺乳動(dòng)物中，跨膜蛋白和脂質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞外蛋白(如內(nèi)貼蛋白)都與微囊泡和外泌體有關(guān)。外泌體的跨膜蛋白富含四聚體蛋白(如CD9、CD63和CD81)一個(gè)具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)超家族。四聚體蛋白參與細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)和生物合成的成熟，在外泌體中高表達(dá)，這一特性使得四聚體蛋白被用于外泌體的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚體蛋白并不只在外泌體中唯一表達(dá)。另一方面，微囊泡富含整合素、選擇素和CD40配體，表明它們來自于細(xì)胞的質(zhì)膜，EV富含特異的跨膜蛋白受體(如表皮生長(zhǎng)因子受體/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮細(xì)胞黏附分子/EpCAM)。由于許多跨膜蛋白參與了正常生理和疾病的發(fā)病機(jī)制，它們被用作重要的病理生理學(xué)EV生物標(biāo)志物。
5.1.2. Intravesicular Proteins
EV相關(guān)的囊內(nèi)蛋白具有多種功能。它們包括具有膜或受體結(jié)合能力的參與囊泡運(yùn)輸?shù)陌|(zhì)蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV還富含細(xì)胞骨架蛋白(如:內(nèi)酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侶蛋白(如:熱休克蛋白/HSPs)、代謝酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脫氫酶/GAPDH和核糖體蛋白)。有趣的是，最近的研究發(fā)現(xiàn)EV蛋白可以被受體細(xì)胞有效地運(yùn)輸和接收，從而在體內(nèi)和體外引起強(qiáng)烈的細(xì)胞反應(yīng)。這帶來了EV作為治療和藥物載體的新機(jī)遇。
5.2. Conventional Protein Analyses
EV蛋白的定量和特征鑒定不僅對(duì)闡明EV的生物發(fā)生和cargo sorting有重要意義，而且對(duì)鑒別生理和病理標(biāo)志物也有重要意義。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析，包括Western blotting和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，通常需要大樣本量、大量處理和/或龐大的專門儀器，因而不太適合臨床應(yīng)用。
5.2.1. Western Blotting and ELISA.
在EV蛋白評(píng)估時(shí)，Western blotting可能是最常用的技術(shù)，用于提示與EV相關(guān)的靶蛋白的存在。在這個(gè)過程中，純化的囊泡制劑(通常通過現(xiàn)行的梯度超離心法金標(biāo)準(zhǔn)制備)可以用含有變性劑和蛋白酶抑制劑的緩沖裂解液進(jìn)行處理。然后用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS?PAGE)分離蛋白裂解物，然后轉(zhuǎn)移到膜上，對(duì)特定的蛋白target進(jìn)行免疫印跡。雖然這種方法有很長(zhǎng)的準(zhǔn)備和處理時(shí)間(> 10h)，但是Western blotting可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)分子大小的有用信息。
5.2.2. Mass Spectrometry
不像Western blotting，ELISA只能在相對(duì)較小的范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，質(zhì)譜分析可實(shí)現(xiàn)高通量肽譜分析。純化的EV制劑經(jīng)過酶消化和肽分離，然后用質(zhì)譜儀電離分析。在這個(gè)復(fù)雜的過程中，多個(gè)步驟嚴(yán)重影響EV蛋白組學(xué)分析。除了有效的EV純化，質(zhì)譜分析之前的肽分餾被認(rèn)為是鑒定囊泡蛋白的一個(gè)重要前提。通常通過三種主要方法實(shí)現(xiàn)：(1)SDS?PAGE，(2)二維液相色譜和(3)基于等電聚焦的分餾。
值得注意的是，既然質(zhì)譜分析可以鑒定消化后的肽片段，那么適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)鑒定、定量和驗(yàn)證是必要的。已經(jīng)有兩種用于定量的技術(shù)方法：基于標(biāo)簽的和無標(biāo)簽的。在基于標(biāo)簽的定量分析中，標(biāo)簽(等壓或同位素)被用于比較分析。無標(biāo)簽的定量分析中，色譜強(qiáng)度的譜計(jì)數(shù)被應(yīng)用。識(shí)別出的候選蛋白可以使用其他傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)技術(shù)如Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證。在檢測(cè)靈敏度方面，質(zhì)譜法通常不如基于抗體的技術(shù)敏感。
雖然質(zhì)譜分析需要大量的準(zhǔn)備和處理時(shí)間(數(shù)天)，但它可以提供高通量、定量和EV比較蛋白質(zhì)組分析。到目前為止，已有成千上萬的囊泡蛋白被系統(tǒng)分類，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析?；谫|(zhì)譜的哺乳動(dòng)物和細(xì)菌EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的詳細(xì)討論已經(jīng)在一些綜述中被強(qiáng)調(diào)。這些網(wǎng)絡(luò)和相互作用的研究有助于闡明EV載體的功能活動(dòng)及其在細(xì)胞間遠(yuǎn)距離通信中的重要作用。
5.3. New Protein Analyses
為了解決EV蛋白質(zhì)定量相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)，新一代生物傳感器正在開發(fā)中。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法相比，這些生物傳感器利用獨(dú)特的傳感機(jī)制，可以檢測(cè)各種大小和分子含量的EV。這些技術(shù)中的許多只需要更小的樣本量和更少的樣本處理過程，因此非常適合于醫(yī)療應(yīng)用。
5.3.1. Small Particle Flow Cytometry
流式細(xì)胞術(shù)是一種基于光散射和熒光激活來分選單個(gè)大顆粒(如細(xì)胞或微米大小的實(shí)體)的強(qiáng)大的技術(shù)，然而，傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)對(duì)檢測(cè)直徑小于500 nm的小顆粒的靈敏度和分辨率有限。此外，它還受到高光學(xué)背景的影響，由于鞘層流體中存在小顆粒(約200 nm)。用傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)量化EV時(shí)，大量的小EV可能被忽略或者計(jì)數(shù)偏低：可能同時(shí)有多個(gè)小的囊泡被照亮被計(jì)數(shù)成一個(gè)單獨(dú)的事件，這種現(xiàn)象被稱為“群體理論”。
為了解決傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的弊端，微米大小的乳膠珠被用來綁定多個(gè)囊泡。然后用熒光抗體對(duì)結(jié)合的EV進(jìn)行染色，并對(duì)其蛋白標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。然而，這種方法缺乏分析單個(gè)囊泡的能力，并且不能區(qū)分不同的囊泡亞群，這可能會(huì)導(dǎo)致特征的丟失。
5.3.2. Micro-Nuclear Magnetic Resonance
該技術(shù)主要基于磁性納米粒子(MNPs)。由于大多數(shù)生物物質(zhì)天然缺乏鐵磁背景，這種傳感幾乎不受同系統(tǒng)中其他生物樣品的干擾。因此，即使光學(xué)上渾濁的樣品對(duì)磁場(chǎng)也是透明的；當(dāng)靶分子被特定的MNPs靶向時(shí)，它們與自然的生物背景形成了強(qiáng)烈的對(duì)比。在基于核磁共振(NMR)的磁檢測(cè)中，MNPs置于NMR磁場(chǎng)中，產(chǎn)生局部磁場(chǎng)，改變周圍水分子的橫向弛豫率，放大分析信號(hào)。因此，核磁共振減少了樣本處理過程，提高了檢測(cè)靈敏度，已經(jīng)被開發(fā)用于多個(gè)醫(yī)療點(diǎn)應(yīng)用(例如，直接從血液樣本中檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌)。
但是將這種技術(shù)運(yùn)用在EV檢測(cè)上卻遇到了挑戰(zhàn)，因?yàn)镋V明顯比腫瘤細(xì)胞小1到2個(gè)數(shù)量級(jí)。Shao等人開發(fā)了一種專門用于EV檢測(cè)和蛋白質(zhì)分析的新分析技術(shù)。此方法采用兩步生物正交點(diǎn)擊化學(xué)方法來標(biāo)記EV，這種小分子(<200 Da)標(biāo)記策略并沒有顯著增加抗體或MNP的大小，從而提高了從非結(jié)合抗體和MNPs中保留目標(biāo)囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μN(yùn)MR)直接測(cè)量EV來確定EV生物標(biāo)志物的豐度。
相比傳統(tǒng)的蛋白技術(shù)，μN(yùn)MR系統(tǒng)表現(xiàn)出更好的檢測(cè)靈敏度：比WB和ELASA靈敏103倍。Shao等人利用這種集成技術(shù)可研究在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞系中的EV。比較蛋白分析證實(shí)，EV確實(shí)反映了其親代細(xì)胞的蛋白概況，組合GBM的四種標(biāo)志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)
R132H)可用于區(qū)分癌癥來源的EVs與宿主細(xì)胞來源的EVs。
5.3.3. Nanoplasmonic Exosome (nPLEX) Sensor
鑒于EV的尺寸小，一種新的快速無標(biāo)簽EVs檢測(cè)方案：表面等離子體共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金屬介電界面上傳導(dǎo)電子的集體振蕩。不同于其他基于時(shí)敏熒光和化學(xué)發(fā)光探針的光學(xué)檢測(cè)方法，SPR傳感檢測(cè)金屬-介電介面附近生物分子結(jié)合相關(guān)的局部折射率變化，應(yīng)用于無標(biāo)簽和實(shí)時(shí)檢測(cè)。
5.3.4. Integrated Magnetic-Electrochemical Exosome (iMEX) Sensor
Jeong等人最近開發(fā)了一種新的便攜式傳感器，集成磁-電化學(xué)外泌體(iMEX)，用于EV的快速、流線型分析。iMEX的一個(gè)獨(dú)特之處在于將外泌體的分離和檢測(cè)整合到一個(gè)單一的平臺(tái)中：磁珠用于EV捕獲和標(biāo)記，然后用電化學(xué)傳感來檢測(cè)EV。這種方法有許多實(shí)際的優(yōu)點(diǎn): (i)細(xì)胞特異性外泌體可以直接從復(fù)雜培養(yǎng)基中分離出來，而不需要繁復(fù)的過濾或離心; (ii)該方法結(jié)合了磁富集和酶促擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)較高的檢測(cè)靈敏度; (iii)通過電檢測(cè)方案，傳感器可以很容易小型化和并行擴(kuò)展測(cè)量。
5.3.5. ExoScreen
除了上述的平面?zhèn)鞲衅魍?，Yoshioka等人最近開發(fā)了一種放大的、基于溶液的發(fā)光近距離均勻分析方法，用于快速、靈敏地分析EVs，特別適合應(yīng)用于液體活檢。作者使用光敏劑珠作為直接報(bào)告劑，在血清蛋白分析前不需要任何純化步驟。與ELISA相似，本試驗(yàn)需要兩種類型的免疫珠：(1)供體珠，受680納米激發(fā)釋放單線態(tài)氧，(2)受體珠，僅在離供體珠200 nm范圍內(nèi)被615 nm激發(fā)釋放單線態(tài)氧。在單個(gè)EV上同時(shí)結(jié)合供體珠和受體珠才能產(chǎn)生信號(hào)（只適用直徑< 200 nm的小泡）。因此，這種設(shè)備被稱為“外泌體掃描器”，因?yàn)樗m用于更小的EVs(如外泌體)，可用于多種疾病的生物標(biāo)志物篩選。該檢測(cè)采用先混合再讀取的形式：生物樣本首先用生物素化抗體處理，受體珠與第二抗體結(jié)合。然后加入涂有鏈霉親和素的供體珠以完成近距離分析以獲取數(shù)據(jù)。可以在2 h內(nèi)完成從5μL血清樣本開始建立分析的過程。
5.3.6. Comparison
這些新技術(shù)相比于傳統(tǒng)的方法就是不需要太多的樣本量和復(fù)雜的分離提純過程，可以運(yùn)用微量樣本快速獲取分析結(jié)果。對(duì)比這些新方法的差異可以總結(jié)如下：基于珠子的流式細(xì)胞術(shù)或nPLEX非常適合于高通量篩選，并且比其他方法具有更高的敏感性。然而，這些方法是昂貴的，需要專門的儀器。iMEX和microNMR是互補(bǔ)的系統(tǒng)，可以在較低的設(shè)備成本和生物流體吞吐量下實(shí)現(xiàn)點(diǎn)檢測(cè)。nPLEX和iMEX均已通過大量臨床研究得到驗(yàn)證，目前正在商業(yè)化。小顆粒流式細(xì)胞術(shù)尚處于發(fā)展階段，其本身的吞吐量較低；個(gè)別EV應(yīng)緩慢通過檢測(cè)區(qū)，以確保長(zhǎng)時(shí)間的逗留以獲得良好的信噪比。
6. EV NUCLEIC ACID ANALYSIS
6.1. Nucleic Acids in EVs
EV包含不同形式的RNA和DNA，如下表
RNA是EV攜帶的主要核酸。與細(xì)胞中的RNA相比，eEV運(yùn)輸?shù)腞NA通常更短(通常<200個(gè)核苷酸，但也有長(zhǎng)達(dá)5 kb的)。它們主要是非編碼rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。編碼mRNA (mRNA)已在長(zhǎng)度為200~1000個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄組中被識(shí)別。mRNA可以翻譯成蛋白質(zhì)，而miRNA可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中靶mRNA的翻譯。EV中RNA的數(shù)量和性質(zhì)可以根據(jù)其來源的細(xì)胞類型而變化。
由于它們?cè)谑荏w細(xì)胞中保留了功能，研究人員提出了有趣的假設(shè)，即可能存在專門的機(jī)制將不同的RNA分配給EV運(yùn)輸?shù)教囟ǖ氖荏w細(xì)胞，或可能利用這些機(jī)制運(yùn)送治療性RNA到特定的部位。這是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域，已經(jīng)有一些綜述對(duì)其進(jìn)行闡述。
6.1.1. mRNA
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EV中含有相當(dāng)比例的母細(xì)胞的mRNA，其中許多是細(xì)胞特異性的mRNA。這些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保護(hù)其不被RNA酶降解，使它們成為強(qiáng)有力的循環(huán)生物標(biāo)志物。
此外，已在多個(gè)研究中得到證實(shí)：EV中一些<2 kb的mRNA分子能夠編碼支持蛋白質(zhì)合成的多肽(即，蛋白質(zhì)翻譯的功能)。這些研究強(qiáng)調(diào)了EV作為特定的細(xì)胞信使在影響受體細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞間通訊等多方面的作用。
6.1.2. miRNA
miRNA是一類小的非編碼rna(一般為17 - 24個(gè)核苷酸)，通常通過靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。通過抑制蛋白質(zhì)的翻譯，EV miRNAs在許多生物過程中都是強(qiáng)有力的調(diào)控因子。不同于EV中的循環(huán)mRNA，miRNA可以以多種穩(wěn)定形式存在于體液中。除了被包裹在EV中，循環(huán)miRNA還可以被加載到高密度脂蛋白或結(jié)合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的證據(jù)表明，雖然大多數(shù)循環(huán)miRNA都與RNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，但在EV中也能發(fā)現(xiàn)少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。與mRNA的情況一樣，EVs中的miRNA表達(dá)反映了其細(xì)胞來源，但與親代細(xì)胞略有不同。一些miRNA已被發(fā)現(xiàn)優(yōu)先表達(dá)在EV中，并在受體細(xì)胞中保持功能以調(diào)節(jié)蛋白翻譯。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的胎牛血清可能在體外EV制備過程中導(dǎo)致miRNA偽影。
6.1.3. Other RNA Types
通過NGS，我們還發(fā)現(xiàn)有其他類型的RNA存在EV中。這些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA (lncRNA)。參見上表。
6.1.4. DNA
最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。這些DNA是雙鏈片段，范圍從100個(gè)堿基對(duì)(bp)到2.5 k bp，EV外部還有一些與之相關(guān)的>2.5k bp的DNA片段。這些片段代表整個(gè)基因組DNA，可用于鑒定親代腫瘤細(xì)胞中存在的突變。雖然有可信的證據(jù)表明在EV中存在DNA，但其功能尚未確定。
6.2. Conventional Extraction and Detection Tools
EV核酸作為一種潛在的循環(huán)生物標(biāo)志物和受體細(xì)胞間的調(diào)節(jié)因子已被廣泛研究。傳統(tǒng)的核酸提取和分析工具已經(jīng)成功地為我們理解EV核酸奠定了重要的基礎(chǔ)。由于EVs中核酸的含量較低，開發(fā)高效的提取方法和靈敏的檢測(cè)策略是非常重要的，特別是在小樣本中對(duì)稀有目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)。
6.2.1. Precipitation and Spin Columns
外泌體核酸的提取方法多種多樣。這些通常包括苯酚-氯仿萃取和旋轉(zhuǎn)柱技術(shù)。與細(xì)胞RNA提取一樣，基于酚類物質(zhì)的方法依賴于離心分離：核酸與水相分離，通過乙醇沉淀回收。這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但有可能提取高純度RNA。另一方面，自旋柱是一種固相萃取方法，能夠快速純化RNA。該方法依賴于在潮向性試劑存在下核酸與二氧化硅的強(qiáng)結(jié)合，可在苯酚-氯仿萃取后實(shí)施，以方便處理。
6.2.2. Amplification and Sequencing
提取外泌體核酸要經(jīng)過不同的分析模式：除了驗(yàn)證核酸的質(zhì)量外，通常還要考慮產(chǎn)量、大小、擴(kuò)增和測(cè)序方法等來檢測(cè)和定量EV中的核酸。例如，一個(gè)目標(biāo)序列可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)選擇性擴(kuò)增，并通過終點(diǎn)電泳或?qū)崟r(shí)熒光測(cè)量檢測(cè)(RT - PCR)。雖然這些方法的通量有限，但有助于定量外泌體中已知的目標(biāo)序列。對(duì)于未知的外泌體RNA轉(zhuǎn)錄本的高通量發(fā)現(xiàn)和定量，NGS做出了重要貢獻(xiàn)?；谛蛄械腞NA分析可以產(chǎn)生數(shù)百萬個(gè)具有良好讀取深度和覆蓋范圍的片段，從而有助于從整個(gè)轉(zhuǎn)錄組(包括已知和未知的RNA)進(jìn)行分析和探索。這樣的綜合分析可能為外泌體介導(dǎo)的分子效應(yīng)機(jī)制提供進(jìn)一步的見解，并有助于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。
6.3. New Extraction and Detection Technologies
隨著人們對(duì)利用EV核酸作為微創(chuàng)診斷標(biāo)記的興趣日益濃厚，新的生物傳感器技術(shù)已被開發(fā)出來，使提取和分析變得更加高效、快速。這些新平臺(tái)中有許多提供了對(duì)目標(biāo)核酸標(biāo)記的敏感定量，并且能夠在復(fù)雜的生物學(xué)背景下識(shí)別疾病標(biāo)記，甚至包括單核苷酸點(diǎn)突變。這為個(gè)性化臨床醫(yī)療開辟了許多新的機(jī)會(huì)。
6.3.1. Droplet PCR
雖然傳統(tǒng)PCR是檢測(cè)基因/轉(zhuǎn)錄突變的強(qiáng)大技術(shù)(例如，EGFRvIII缺失突變)，但其敏感性有限，其在檢測(cè)單核苷酸突變方面存在很多不足。這個(gè)問題與EVs特別相關(guān)，因?yàn)樵谝吧娃D(zhuǎn)錄本的大背景中，突變轉(zhuǎn)錄本的比例很低。Chen等人最近采用了一種液滴數(shù)字PCR (ddPCR)技術(shù)來檢測(cè)EV中的罕見突變。
6.3.2. Microfluidics for On-Chip Extraction and Detection
Shao等人最近開發(fā)了一種綜合微流控平臺(tái)，用于現(xiàn)場(chǎng)EV核酸分析，該平臺(tái)集成了三個(gè)功能模塊：靶向富集EVs，芯片上RNA分離，實(shí)時(shí)RNA分析。這個(gè)平臺(tái)被稱為免疫磁性外泌體RNA(iMER)分析平臺(tái)：利用抗體功能化的磁珠從宿主來源的囊泡中分離癌癥特異性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。當(dāng)EV裂解液通過玻璃珠過濾器時(shí)，選擇性吸附EV RNA并從過濾器中洗脫，用于反轉(zhuǎn)錄和qPCR分析。為了簡(jiǎn)化分析過程，所有關(guān)鍵部件都集成到一個(gè)芯片盒中。
隨著該系統(tǒng)的發(fā)展，作者研究了核蛋白的兩個(gè)mRNA靶標(biāo)，MGMT(6-甲基鳥嘌呤)
6.3.3. Ion-Exchange Nanodetector
為了減少EV miRNA檢測(cè)的樣品丟失和處理時(shí)間，tall等人開發(fā)了兩個(gè)系列微流控平臺(tái)，一個(gè)裂解裝置和一個(gè)檢測(cè)裝置，將總分析時(shí)間縮短到～1.5 h，其中包括EV～30 min的裂解和～1 h的檢測(cè)。利用交錯(cuò)換能器使電晶體表面產(chǎn)生聲表面波對(duì)EV進(jìn)行裂解。RNA檢測(cè)則是通過離子交換納米膜傳感器完成的。該傳感器由across two reservoirs的陰離子交換膜橋接組成，當(dāng)電流通過膜時(shí)，陰離子通過膜，產(chǎn)生相應(yīng)的跨膜電流電壓特性(CVC)。通過捕獲寡核苷酸探針使膜表面功能化，然后通過CVC的改變而敏感地定量膜表面的目標(biāo)RNA。
6.3.4. LSPR-Based Assay
局域SPR (LSPR)是由于表面等離子體在大小與入射光波長(zhǎng)相當(dāng)或更小的納米顆粒中的限制而產(chǎn)生的。不同于SPR，LSPR誘導(dǎo)的等離子激元在納米結(jié)構(gòu)上局部振蕩，而不是沿著金屬-介電界面振蕩。因此，LSPR中的電磁場(chǎng)衰減得更快。這種較短的場(chǎng)衰減長(zhǎng)度(<100 nm)減少了傳感器對(duì)體折射率變化的干擾，提高了對(duì)表面小生物分子結(jié)合的敏感性。Joshi等人利用LSPR在檢測(cè)小生物分子方面的優(yōu)勢(shì)，最近開發(fā)了一種使用附著在固體基質(zhì)上的化學(xué)合成納米金的敏感miRNA傳感器。該傳感器的制作分為兩個(gè)步驟：(1)化學(xué)合成直徑約40納米的金納米顆粒，并以共價(jià)附著在玻璃襯底上；(2)通過捕獲DNA探針和聚乙二醇隔離劑對(duì)固定化納米顆粒進(jìn)行功能化處理。由于其原子平面的均勻填料以及其鋒利的納米顆粒尖端的強(qiáng)電磁場(chǎng)增強(qiáng)，該傳感器實(shí)現(xiàn)了較高的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)限為91 aM。
7. CLINICAL APPLICATIONS OF EV ANALYSES
隨著越來越多的證據(jù)表明EVs在細(xì)胞間通訊中具有多種代表性的生物分子和重要的功能，其臨床應(yīng)用得到了極大的發(fā)展。疾病來源的EV被研究以改進(jìn)診斷方法。此外，它們還可以作為治療的有效工具。
7.1. Cancer Diagnostics
腫瘤是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包括惡性細(xì)胞和周圍的基質(zhì)細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞。最近的研究表明，EVs在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)細(xì)胞間通訊，從而調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展，并且在治療反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。
7.1.1. Glioblastoma Multiforme
多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤GBM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。由于侵入性腦活檢的復(fù)雜性，GBM重復(fù)活檢面臨重大挑戰(zhàn)。先前的研究表明，GBM將大量的癌癥特異性EVs釋放到血液循環(huán)中。Skog等人的早期研究發(fā)現(xiàn)這些囊泡可以通過血腦屏障。GBM EV被發(fā)現(xiàn)含有mRNA、miRNA以及血管生成蛋白。
這一大塊兒的其他內(nèi)容大家感興趣的話可以閱讀原文獻(xiàn)。
7.2. Neurodegenerative Diseases
在大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森病、額顳葉癡呆)中存在類似的疾病進(jìn)展模型，其中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)自結(jié)合形成有序的聚合體并在細(xì)胞中聚集。阿爾茨海默病(AD)中，淀粉樣蛋白的Abeta肽的形成可能是這些蛋白聚合體中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一種類型的聚合體在細(xì)胞內(nèi)形成，主要由alpha-synuclein(突觸核蛋白)組成，稱為路易小體。最近的研究表明，許多神經(jīng)退行性疾病中涉及的錯(cuò)誤折疊蛋白出現(xiàn)在EV中。因此，這些囊泡為檢測(cè)和監(jiān)測(cè)神經(jīng)退行性疾病帶來了新的希望。
AD是一種遲發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。河捎谏窠?jīng)變性而導(dǎo)致記憶和認(rèn)知能力的逐漸喪失。雖然AD的確切病因仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題，但很明顯，與Aβ肽相關(guān)的斑塊沉積和與tau蛋白相關(guān)的神經(jīng)纖維纏結(jié)對(duì)疾病的進(jìn)展是非常重要的。這些淀粉樣肽來源于淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白水解過程。這一過程可以發(fā)生在細(xì)胞的多個(gè)位置，特別是在調(diào)節(jié)內(nèi)小泡循環(huán)的途徑中，這也與EV的形成很相關(guān)。Rajendran等人確定Aβ肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到多泡體(multivesicular bodies)中。在EV中發(fā)現(xiàn)了一小部分Aβ肽被分選到腔內(nèi)囊泡并輸出到細(xì)胞外。作者還發(fā)現(xiàn)，外泌體蛋白可在AD患者大腦斑塊中積累，提示EVs在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。
最近，Kapogiannis等人發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗通路標(biāo)記物也可以用于AD的檢測(cè)。在AD和2型糖尿病患者中，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致大腦相關(guān)區(qū)域葡萄糖攝取減少。通過免疫親和捕獲法從血漿樣本中富集神經(jīng)EV，研究人員調(diào)查了對(duì)照組(這些患者的樣本在AD診斷前1 - 10年獲得)和AD患者(PC-AD)中磷酸化的絲氨酸-1型胰島素受體底物(IRS-1)的表達(dá)。有趣的是，在EVs中可以發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記物，與對(duì)照樣本相比IRS-1的水平在AD的臨床前和AD明顯癥狀階段都升高了。
7.3. Acute Organ Injury
這部分不詳細(xì)描述了，感興趣的可以閱讀原文。
7.4. Therapeutic Potential
EVs是生物活性物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA)的內(nèi)源性載體。最近的研究表明，EV參與了物質(zhì)的傳遞和功能信息的交換，從而調(diào)節(jié)病理生理過程，激活細(xì)胞間的遠(yuǎn)程通信。目前的EV分類主要基于囊泡的生物發(fā)生，對(duì)于囊泡中的生物活性物質(zhì)與其分類之間的相關(guān)性或囊泡的亞群是否具有不同功能的了解甚少，弄清楚這些有助于更好地理解EV作為循環(huán)生物標(biāo)志物的診斷潛力以及用于傳遞治療的生物活性功能。
迄今為止，EVs已被直接或工程應(yīng)用于多種用途的治療劑，如再生醫(yī)學(xué)、癌癥治療、和免疫調(diào)節(jié)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，來自間充質(zhì)干細(xì)胞的EV在心肌梗死、腎臟損傷和骨骼肌修復(fù)模型中具有有益的旁分泌作用。這種旁分泌效應(yīng)依賴于通過EV向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)、生物活性脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)，為消除干細(xì)胞直接移植的安全隱患提供了可能。
EVs也可以用于投遞治療性物質(zhì)。有兩種不同的方法被用于EVs基因治療。在第一項(xiàng)研究中，封裝在囊泡中的腺相關(guān)病毒(AAV)載體被證明在向受體細(xì)胞傳遞遺傳物質(zhì)方面比自由載體更有效且具有更少的免疫原性。在第二項(xiàng)研究中，通過轉(zhuǎn)染的親代細(xì)胞分泌含有自殺基因mRNA和蛋白質(zhì)的囊泡。這些囊泡在正交各向異性小鼠模型(與全身前藥治療相結(jié)合)中被反復(fù)注射在神經(jīng)鞘瘤腫瘤從而使腫瘤消退。
8. CONCLUSIONS AND OUTLOOK
總的來說，EV包含多種細(xì)胞成分，不僅反映母細(xì)胞，而且影響腫瘤微環(huán)境和疾病進(jìn)展。因?yàn)槠洚愘|(zhì)性和分子量小導(dǎo)致無法運(yùn)用簡(jiǎn)單的方法對(duì)EV進(jìn)行研究。正如本文所述，許多新的分析平臺(tái)正在開發(fā)和優(yōu)化，以使EV的分析比傳統(tǒng)方法更方便和敏感。這些平臺(tái)可以為新興的EV生物學(xué)提供見解，并將EV定位為(1)一種潛在的非侵入性生物標(biāo)志物，以指導(dǎo)個(gè)性化醫(yī)療；(2)一種新的治療方法，用于傳遞內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子(如免疫激活因子)或外源性治療(如藥物和蛋白質(zhì))。
最后，我們提出了進(jìn)一步改進(jìn)EV測(cè)定的關(guān)鍵方面。首先，應(yīng)建立測(cè)定校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品。與其他分析測(cè)試一樣，EV測(cè)試樣品對(duì)處理過程非常敏感；EV計(jì)數(shù)、類型和分子含量隨收集方法、儲(chǔ)存介質(zhì)和檢測(cè)本身的不同而不同。制定EV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)將減少由于協(xié)議差異而產(chǎn)生的不一致性，提高檢測(cè)的重現(xiàn)性，并實(shí)現(xiàn)無偏差的跨平臺(tái)比較。因此，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院正在開發(fā)一個(gè)細(xì)胞外RNA作為生物標(biāo)志物的參考數(shù)據(jù)庫(kù)。其次，為了建立疾病狀態(tài)的可靠基準(zhǔn)，匹配的對(duì)照樣本是很重要的，因?yàn)槿祟惿硪蛩?如性別和年齡)可能影響EV的產(chǎn)生和組成。統(tǒng)計(jì)分析也應(yīng)該把這些因素作為與EV分子信息一起作為變量考慮進(jìn)去。最后，需要開發(fā)一種單EV分析技術(shù)來闡明EV的生物發(fā)生、分子組成和多樣性，類似單細(xì)胞測(cè)序的意義。大多數(shù)新的分析平臺(tái)，雖然優(yōu)于傳統(tǒng)的方法，仍然需要大量的EV起始量，得到是一小群囊泡的群體表征特性。分析單個(gè)EV可以揭示細(xì)胞特異性EV的獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)，這將進(jìn)一步促進(jìn)囊泡的創(chuàng)新臨床應(yīng)用(例如，診斷和藥物載體)，并使我們能夠根據(jù)不同的物理/生物參數(shù)(例如，囊泡大小、起源和細(xì)胞狀態(tài))構(gòu)建一個(gè)完整的EV圖譜。
