測序read數(shù)會(huì)受到基因長度和測序深度影響，解決方案如下：
1、基因長度影響--將測序Read數(shù)除以基因長度；2、測序深度影響--將Read數(shù)除以總Read數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化
簡寫
RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百萬映射讀取的reads)
--本次某個(gè)基因read數(shù)/本次測序總read數(shù)（先對測序深度歸一化）
RPKM: Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的reads)
--（某樣本特定基因read數(shù) /某樣本測序總read數(shù)）*10^3 *10^6/ 基因長度 （先對測序深度歸一化得到RPM，再對基因長度歸一化RPKM）
FPKM: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments)
--（某樣本特定基因read數(shù) /某樣本測序總read數(shù)）*10^3 10^62（雙端）/ 基因長度（先對測序深度歸一化得到FPM，再對基因長度歸一化得到FPKM）
TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts)
--（某樣本特定基因read數(shù)/基因長度）*10^3 *10^6 /某樣本測序總read數(shù)（先進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化得到RPK，后進(jìn)行測序深度標(biāo)準(zhǔn)化得到TPM ）
RPKM
RPKM--代表每百萬reads中來自于某基因每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄得到的reads數(shù)。是將map到基因的read數(shù)除以map到基因組上的所有read數(shù)(以million為單位)與RNA的長度(以KB為單位)之積。
total exon reads：樣本中某個(gè)基因mapping到外顯子上的所有的reads數(shù)
mapped reads (Millions) ：樣本總reads數(shù)
exon length(KB)：某個(gè)基因的長度（外顯子長度的總和，以KB為單位）
FPKM
FPKM與RPKM計(jì)算方法基本一致。FPKM 計(jì)算的是DNA片段(fragments)，也就是一對reads。與RPKM 的差別主要體現(xiàn)在，F(xiàn)PKM在一對reads map上的情況下只計(jì)數(shù)1，而RPKM 會(huì)計(jì)為2。適用于雙端測序。
在單端測序中，一個(gè)Fragments只測一條Reads，所以，Reads數(shù)與Fragments數(shù)目相等；
在雙端測序中，一個(gè)Fragments測兩端，會(huì)得到2條Reads，但由于后期質(zhì)量或比對的過濾，有可能一個(gè)Fragments的2條Reads最后只有一條進(jìn)入最后的表達(dá)量分析。
總之，對某一對Reads而言，這2條Reads只能算一個(gè)Fragments，所以，F(xiàn)ragment的最終數(shù)目是Reads的1到2倍之間？？
FPKM（RPKM）適用于：同一個(gè)樣本中基因A和基因B的相對表達(dá)量
TPM
TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts)
Ni：比對到第i個(gè)exon的reads數(shù)
Li：第i個(gè)exon的長度
sum(N1/L1+N2/L2 + ... + Nn/Ln)：所有 (n個(gè))exon按長度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后數(shù)值的和
TPM其實(shí)跟RPKM，F(xiàn)PKM也很相似。TPM唯一不同的地方就是計(jì)算次序不一樣。所以，當(dāng)計(jì)算TPM的時(shí)候，先對基因長度進(jìn)行歸一化，其次是測序深度的歸一化。然而，歸一化次序不一樣，對結(jié)果影響差別就很大。當(dāng)使用TPM時(shí)候，每個(gè)樣本的TPM總和是一樣的（=10^6）。這使得比較同一個(gè)基因的reads數(shù)在不同樣本間的比例變得容易。FPKM和RPKM與此相反，每個(gè)樣本的FPKM或RPKM的累加和可以不一樣，造成樣本間不能直接比較FPKM或RPKM值。
