ChIP-seq簡(jiǎn)介
概念: ChIP-Seq是用于在全基因組范圍中研究DNA結(jié)合蛋白（相互反應(yīng)）、組蛋白修飾（表觀遺傳標(biāo)記）和核小體的技術(shù)，研究這三個(gè)主題可有助于了解基因之間的相互調(diào)控以及染色體的功能結(jié)構(gòu)。
ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)原理: 在生理狀態(tài)下，把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)（Crosslink）后裂解細(xì)胞，分離染色體，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)隨機(jī)切割，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)，再通過(guò)反交聯(lián)（Reverse crosslink）釋放結(jié)合蛋白的DNA片段，最后測(cè)序獲得DNA片段的序列。
注意:當(dāng)研究重點(diǎn)是得到核小體的位置和組蛋白修飾的位置的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)中并不首先進(jìn)行crosslink，而是用超聲或者M(jìn)Nase直接進(jìn)行打斷，優(yōu)先使用MNase，可以更高效地去除掉linker DNA片段以得到核小體更為精確的位置。
空白對(duì)照:：空白對(duì)照是必要的，存在很多假陽(yáng)性情況，舉例：1. 開(kāi)放的染色體區(qū)域更容易被打斷成片段，這樣導(dǎo)致tag數(shù)在基因組上的分布是不均勻的;2.很多重復(fù)序列會(huì)使做map的時(shí)候得到結(jié)果難以解釋。空白對(duì)照的用途：可以判斷由ChIP-Seq得到的peak時(shí)候具有統(tǒng)計(jì)上的顯著性。
三種類(lèi)型的空白對(duì)照：1.部分進(jìn)行免疫共沉淀前的DNA（input DNA），這是最常用的；2.由免疫共沉淀得到而不含有抗體的DNA(mock IP DNA)，使用這個(gè)的一個(gè)問(wèn)題是收集到的量可能不夠；3.使用非特異免疫共沉淀方法得到的DNA.
SRA數(shù)據(jù)下載
以擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AP1為例(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE46986), 下載對(duì)應(yīng)的ChIP-seq(SRR851698)和Control(SRR851703)數(shù)據(jù)
axel -n 20 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR851/SRR851703/SRR851703.sra
axel -n 20 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR851/SRR851698/SRR851698.sra
SRA轉(zhuǎn)換為FASTQ
# 參數(shù)--split-3可自動(dòng)識(shí)別單端還是雙端數(shù)據(jù)
fastq-dump --split-3 SRR851703.sra
fastq-dump --split-3 SRR851698.sra
Trimmomatic過(guò)濾低質(zhì)量的reads
# 該示例數(shù)據(jù)未單端
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -phred33 SRR851703.fastq SRR851703_filtered.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -phred33 SRR851698.fastq SRR851698_filtered.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
# 對(duì)于雙端數(shù)據(jù)集
java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 input_1.fastq input_2.fastq input_1_paired.fq input_1_unpaired.fq input_2_paired.fq input_2_unpaired.fq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
除此之外，Trimmomatic還包含illumina測(cè)序平臺(tái)的常用接頭，因此也可以用于去接頭
# 單端
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -phred33 SRR851703.fastq SRR851703_filtered.fastq ILLUMINACLIP:～/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
# 雙端
java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 input_1.fastq input_2.fastq input_1_paired.fq input_1_unpaired.fq input_2_paired.fq input_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP:～/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
注意：～/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa 應(yīng)為絕對(duì)路徑
比對(duì)到參考基因組
擬南芥(Arabidopsis thaliana)參考基因組下載
wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-40/fasta/arabidopsis_thaliana/dna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna_sm.toplevel.fa.gz
gunzip Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna_sm.toplevel.fa.gz
mv Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna_sm.toplevel.fa arabidopsis_genome.fa
Bowtie比對(duì)
為基因組序列創(chuàng)建index
bowtie-build arabidopsis_genome.fa
使用默認(rèn)參數(shù)比對(duì)
# alignment
bowtie arabidopsis_genome.fa SRR851703_filtered.fastq -S SRR851703.sam
bowtie arabidopsis_genome.fa SRR851698_filtered.fastq -S SRR851698.sam
# Conver to bam
samtools view -bS SRR851703.sam > SRR851703.bam
samtools view -bS SRR851698.sam > SRR851698.bam
# sort
samtools sort -o SRR851703.sort.bam SRR851703.bam
samtools sort -o SRR851698.sort.bam SRR851698.bam
# Creat index
samtools index SRR851703.sort.bam
samtools index SRR851698.sort.bam
# Extract uniquely mapped reads
samtools view -h -q 255 SRR851703.sort.bam | samtools view -bhS - > SRR851703_unique_mapped.bam
samtools view -h -q 255 SRR851698.sort.bam | samtools view -bhS - > SRR851698_unique_mapped.bam
MACS2 peak calling
macs2 callpeak -t SRR851698_unique_mapped.bam -c SRR851703_unique_mapped.bam -f BAM -g 1.35e8 -n AP1 -q 0.05
