實(shí)驗(yàn)原理

?在EDTA和SDS等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提，可以得到哺乳動構(gòu)基因組DNA，用此方法得到的DNA長度為100-150 kb，適用于構(gòu)建基因組文庫和 Southern分析。

通過本實(shí)驗(yàn)了解并掌握提取基因組DNA的原理和步驟，以及相對分子質(zhì)量較大的DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。

儀器、材料與試劑

(一)儀器

1 . 臺式離心機(jī)

2 . 玻璃勻漿器

3 . 高壓滅菌鍋

4 . 恒溫水浴鍋

(二)材料

1．1.5mL微量離心管

2．微量取樣器和吸頭

3．無菌過濾器(一次性)

4．10 mL注射器

5．鼠肝

6．三羥甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸鈉(SDS)

?8．乙二胺四乙酸(EDTA)

?9．蛋白酶K

10．RNA酶

11．DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物，DNA／EcoRI+HindⅢ相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物

?(三)試劑

1、1.5 mol／L??? NaCl

2、0.5 mol／L Tris·HCI??? pH8.0

3．0.5 mol／L EDTA??? pH8.0

4．3 mol／L NaAc??? pH5.2

?以上均高壓滅菌。

5．蛋白酶K? 10mg／mL配好后用一次性過濾器過濾，-20 ℃ 保存

6 .? 組織勻漿液? 100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)

7．酶解液? 200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS

8．無DNA酵的RNA酶 ： 將胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol／L? NaCl溶液中，濃度l0mg／mL，于100℃水浴處理15min，以降解DNA酶，緩慢冷卻到室溫，-20℃保存

9．TE緩沖液 ：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)

10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：異戊醇=25：24：1（體積比）

11．氧仿：異戊醇=24：1(體積比)

12．5xTBE? 5．4gTris，2．75g硼酸? 2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；

13．6x上樣緩沖液? 0.25％溴酚藍(lán)，40％(W／V)蔗糖水溶液

14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ 相對分于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125

實(shí)驗(yàn)步驟

????本實(shí)驗(yàn)在無液氮的條件下，制備鼠肝DNA，與有液氮條件下相比，產(chǎn)量和質(zhì)量都有所下降。整個(gè)操作過程中，應(yīng)盡量避免DNA酶的污染，特別注意動作溫和，減少對DNA的機(jī)械損傷。

1、取0.2g鼠肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然后置于2.0mL勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在(冰浴操作，切勿將細(xì)胞破碎，可鏡檢觀察)。

2、將組織細(xì)胞移至1.5ml離心管中，50000rpm離心30-60sec，(盡可能在低溫下操作)，棄上清，若沉淀中血細(xì)胞較多，可再加入細(xì)胞體積的一倍勻漿液洗一次。

3、沉淀加0.8mL無菌水迅速吹散，分兩管，再加0.4mL酵解液，翻轉(zhuǎn)混勻(動作一定要輕)55℃水浴處理12-18 h；

4、沉淀加RNase至終濃度200μg／mL，37℃水浴1 h；

5、加入等體積酚／氯仿／異戊醇抽提一次，(慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，傾斜使兩相接觸面增大)。4℃、10min、10000rpm離心；

6、有時(shí)如果DNA含量過高，水相在下層，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意觀察。用吸頭移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等體積氧仿／異戊醇，4℃、10 000rrpm離心10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重復(fù)1．6操作)。

7、用吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的NaAc，小心混勻(要充分)，再向每管中加入2.5倍體積的無水乙醇，-20℃? 過夜。

8、12 000rpm離心19min，棄上清，75％冷乙醇洗滌一次，12000rpm離心15min室溫干燥(不要太干，否則DNA不易溶解)，加入適量TE緩沖液，存放于4℃，輕搖溶解過夜，即可得到實(shí)驗(yàn)動物基因組DNA。

9、電泳鑒定DNA，由于基因組DNA相對分子質(zhì)量較大，用0.3％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，先在底部鋪一層1％的支持膠，凝固后再鋪上一層0.3％瓊脂糖凝膠，插上梳子(梳子不能碰到支持膠)。取1.5μL溶解的DNA、1μL上樣緩沖液和35μl無菌水混勻后小心上樣(可在另一孔加DNA相對分于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))，觀察基因組DNA大小，用溴化乙錠染色觀察結(jié)果。

[注意事項(xiàng)]

1、操作過程盡量在低溫下進(jìn)行，避免DNA降解。

2、瓊脂糖凝膠脆弱，應(yīng)小心操作。

3、提取得到的基因組DNA應(yīng)為單一條帶，DNA降解可形成彌散帶型。