二代測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)類(lèi)型
常規(guī)的下一代高通量測(cè)序（next generation sequencing, NGS）實(shí)驗(yàn)通常產(chǎn)生大量短片段(reads)，通常我們需要將這些reads比對(duì)到參考基因組/轉(zhuǎn)錄組上，即將它們置于生物學(xué)上有意義的基因背景下，才能獲得有意義的結(jié)果。一般我們認(rèn)為會(huì)產(chǎn)生兩種類(lèi)型的數(shù)據(jù)（當(dāng)然兩者并無(wú)嚴(yán)格意義上的區(qū)分）：
1.表達(dá)類(lèi)
一般為固定區(qū)域，關(guān)注于定量比較。例如轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，數(shù)據(jù)庫(kù)中已有mRNA基因的表達(dá)，lncRNA基因的表達(dá)等，這類(lèi)結(jié)果一般以矩陣形式存儲(chǔ)，第一列是名字，其余列是表達(dá)值。CircRNA表達(dá)，miRNA表達(dá)等歸于此類(lèi)。
2.基因組區(qū)域（富集峰)類(lèi)
一般區(qū)域不固定，關(guān)注于定性。例如ChIP-seq、ATAC-seq、Cut&tag等比對(duì)后獲得的富集峰。一般以bed格式存儲(chǔ)，第一列是染色體，第二列是富集峰起始坐標(biāo)，第三列是富集峰終止坐標(biāo)（圖1）。eccDNA，m6A，MeDIP等歸于此類(lèi)。
什么是富集峰注釋?zhuān)?/b>
基于抗體富集的原理，眾多reads片段比對(duì)到基因組上某區(qū)段，會(huì)形成一個(gè)類(lèi)似山峰的富集區(qū)。由于我們是在基因組背景下進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究的，因此需要將基因組區(qū)域（富集峰，peak）與基因聯(lián)系起來(lái)，即確定峰落在哪個(gè)基因上，落在該基因的哪種基因組特征上，距離TSS的位置是多少bp等，然后才能進(jìn)行后續(xù)的功能研究。這個(gè)過(guò)程叫做富集峰注釋?zhuān)╬eakannotation，圖2）。如果僅關(guān)注某幾個(gè)區(qū)域，就不需要用軟件注釋?zhuān)ㄗh直接用IGV或者UCSC Genome Browser查看。
富集峰注釋的難點(diǎn)
雖然CHIP-Seq已經(jīng)有近20年的歷史，然而由于基因組上基因的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，不同注釋軟件在具體細(xì)節(jié)處理上往往不同，從而導(dǎo)致同一批數(shù)據(jù)，用不同的軟件進(jìn)行注釋?zhuān)@得的結(jié)果略有不同（大同小異）。
1.注釋到轉(zhuǎn)錄本還是注釋到基因？
由于一個(gè)基因可能包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，因此，我們?cè)谧⑨尩臅r(shí)候，到底是注釋到基因水平還是注釋到轉(zhuǎn)錄本水平？
2.基因位置重疊怎么處理？
由于同一個(gè)位置可能存在多個(gè)基因，如果兩個(gè)基因的坐標(biāo)有重疊，我們到底是注釋到A基因還是注釋到B基因？
3.最鄰近怎么判斷？
如果富集峰的中點(diǎn)（或者頂點(diǎn)）正好落在兩個(gè)基因的中間，那么這個(gè)富集峰是注釋到A基因還是注釋到B基因，如何定義最鄰近？
4.基因組特征如何分類(lèi)？
不同文章、軟件對(duì)基因組特征分類(lèi)不同，例如有的分為promoter、intron、exon，5’UTR和3’UTR；有的分為：upstream、promoter、intron、exon、downstream等
5.如何定義？
不同文章、軟件定義promoter區(qū)也不同，有的定義TSS上游3K到下游3K都是promoter，有的定義TSS上游200bp到下游800bp是啟動(dòng)子。
6.不同基因組特征的注釋優(yōu)先級(jí)
當(dāng)一個(gè)很長(zhǎng)的富集峰橫跨同一個(gè)基因的intron、exon、3’UTR時(shí)候，這個(gè)富集峰該分到什么特征中呢？
7.注釋數(shù)據(jù)庫(kù)版本問(wèn)題
同樣是human hg38，如果注釋庫(kù)版本不同，那么注釋結(jié)果也會(huì)有差異。原因是：雖然基因組序列不變，然而注釋庫(kù)卻更新頻繁，有基因會(huì)更新坐標(biāo)，有基因會(huì)添加新的轉(zhuǎn)錄本，有基因會(huì)從非編碼基因變成編碼基因等。
凡此種種，給我們的注釋工作帶來(lái)了巨大困難。然而，作為用戶(hù)（調(diào)包俠），我們基本不用深究注釋背后的細(xì)節(jié)。我們需要做的就是：找一個(gè)引用比較多的注釋工具，默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行注釋即可。
常見(jiàn)富集峰注釋軟件
為什么要用新版注釋?zhuān)?/b>
由于注釋數(shù)據(jù)庫(kù)頻繁更新，如果你使用的注釋還是N年前的，那么reviewer在公共數(shù)據(jù)庫(kù)（例如UCSC、Ensembl、NCBI）上使用網(wǎng)站默認(rèn)版本查詢(xún)時(shí)，就有可能查不到你的基因，或者你N年前的數(shù)據(jù)，與新的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析時(shí)，由于使用的注釋數(shù)據(jù)庫(kù)不同，取交集時(shí)，會(huì)漏掉一些基因。因此，我們強(qiáng)烈建議所有的測(cè)序數(shù)據(jù)，包括RNA-seq、ChIP-seq、m6A-seq等都使用同一套注釋庫(kù)進(jìn)行注釋分析，并在結(jié)果中明確說(shuō)明所使用的注釋庫(kù)版本。這對(duì)于在不同公司，不同時(shí)間做的測(cè)序結(jié)果來(lái)說(shuō)，是非常重要的。
由于上述所列在線工具都是N年前的，所以我們使用ChIPSeeker R包搭建了一個(gè)簡(jiǎn)易的在線peak注釋工具，可以對(duì)人、大鼠、小鼠的ChIP-seq，ATAC-seq，cut&tag等富集峰進(jìn)行一鍵注釋。
1,打開(kāi)繪圖頁(yè)面
首先，使用瀏覽器（推薦chrome或者edge）打開(kāi)ChIP-Seq富集峰注釋頁(yè)面。左側(cè)為常見(jiàn)作圖導(dǎo)航，中間為數(shù)據(jù)輸入框和可選參數(shù)，右側(cè)為描述和結(jié)果示例。也可以在搜索框中搜索peak，找到注釋頁(yè)面。
http://www.bioinformatics.com.cn/basic_chipseq_atacseq_peak_annotation_by_chipseeker_t017
2，示例數(shù)據(jù)
點(diǎn)擊右側(cè)“示例數(shù)據(jù)”鏈接下載excel格式的示例數(shù)據(jù)。
示例數(shù)據(jù)包括4列，分別為：chr，start，end，-LOG10(pvalue)。
注意：為了遵循各大數(shù)據(jù)庫(kù)的使用，這里染色體必需使用chr+數(shù)字，即：chr1-22、chrX、chrY、chrM等。
3，粘貼示例數(shù)據(jù)
直接拷貝示例數(shù)據(jù)中的ABCD四列數(shù)據(jù)，然后粘貼到輸入框。注意必需帶每一列的說(shuō)明行（header），此行將用于最終的excel表頭。
注意：不是拷貝excel文件，是拷貝excel文件里邊的數(shù)據(jù)。另外粘貼到輸入框后，格式亂了沒(méi)關(guān)系，只要在excel中是整齊的就行。同時(shí)數(shù)據(jù)矩陣中不能有空的單元格，中文字符等。
4，修改參數(shù)，并提交
我們?cè)O(shè)置了promoter區(qū)的范圍選項(xiàng)，及注釋所用的物種及注釋版本選項(xiàng)（例如human所使用的是hg38基因組，注釋版本為Ensembl v108），當(dāng)前僅支持human，mouse和rat。后續(xù)將支持更多物種。
5，提交出圖
粘貼好輸入數(shù)據(jù)，調(diào)整好參數(shù)（重點(diǎn)是物種及注釋版本）后，點(diǎn)擊提交按鈕，約30秒鐘后（取決于數(shù)據(jù)多少），會(huì)在頁(yè)面右側(cè)出現(xiàn)peak分類(lèi)餅圖及excel格式的數(shù)據(jù)下載鏈接，請(qǐng)下載后解壓查看。
結(jié)果說(shuō)明
以peak_class為界，結(jié)果包括兩部分：左側(cè)為輸入的內(nèi)容，其中start添加了1 bp（因?yàn)閎ed格式是0-based，這里變成了1-based），并添加了peak長(zhǎng)度信息（end-start+1）；右側(cè)為注釋信息，包括：peak分類(lèi)，基因位置，基因/轉(zhuǎn)錄本注釋等信息。并基于peak_class的數(shù)據(jù)繪制了peak分布餅圖。
注意：
1，由于peak注釋與注釋庫(kù)及優(yōu)先級(jí)關(guān)系密切，因此最終放在paper里邊的圖，以IGV可視化結(jié)果為準(zhǔn)。
2,輸入peak默認(rèn)不考慮鏈，如需更精細(xì)地注釋?zhuān)?qǐng)參考ChIPSeeker R包。
3,默認(rèn)一個(gè)peak僅注釋到一個(gè)轉(zhuǎn)錄本
沒(méi)有預(yù)覽就是沒(méi)有出圖/結(jié)果，這時(shí)請(qǐng)參考示例數(shù)據(jù)，檢查輸入數(shù)據(jù)的格式?；蛘呤褂梦覀兲峁┑男」ぞ?a href="http://www.itdecent.cn/p/20b005b360a0" target="_blank">pyinstaller打包python腳本為exe可執(zhí)行文件實(shí)例：錯(cuò)誤排查小腳本檢查輸入。
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