舉例說明圖位克隆的方法、過程及優(yōu)缺點

該方法分離抗病基因首先要構(gòu)建一個覆蓋目的基因區(qū)域的精密分子標(biāo)記遺傳連鎖圖，以此為基礎(chǔ)進一步制作覆蓋目標(biāo)基因區(qū)域的物理圖譜，獲得包含目的基因的克隆。從理論上講，任何一個能定位的基因都可用圖位克隆法分離，且該方法已被廣泛采用并證明行之有效。

用圖位克隆法克隆目的基因，有三個步驟：第一步是目的基因的染色體定位并找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。一般說來，第一步的完成并不困難，但要獲得一張精密的該區(qū)段分子標(biāo)記連鎖圖，往往需要一個較大的群體，將基因定位于一個非常狹小的區(qū)段內(nèi)。這一步工作做的越細(xì)，后面的工作越容易。例如：水稻抗稻瘟病基因Pib的克?。╓ang et al. 1999），僅感病單株就用了3305株。利用這些單株將基因定位于0.06cM的區(qū)段內(nèi)，如此狹窄的區(qū)段，可直接利用小片段的Cosmid文庫覆蓋這一區(qū)域，大大縮短了后續(xù)工作的時間，減少了工作量。此外，若所用的物種在該區(qū)段已有大量的分子標(biāo)記定位或一張高密度連鎖圖（如擬南芥、水稻），會大大加快工作進度。第二步用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選大片段基因組文庫（YAC或BAC文庫），以陽性克隆末端及其亞克隆進行染色體步查，構(gòu)建覆蓋目的基因區(qū)域的物理圖譜，獲得含目的基因的克隆；這一步對第一步的工作和所用物種依賴性極大。第三步候選基因的鑒定及其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的分析?；蜩b定工作，一般有兩種方法－轉(zhuǎn)化互補法和突變體的利用法。應(yīng)用較多的是前者，主要是將所分離的基因轉(zhuǎn)入非抗病的品種中，鑒定轉(zhuǎn)化植株是否能抗同一生理小種，若能，則說明已分離到目的基因（Bent et al.1994，Martin et al. 1993，Song et al. 1995，Yoshimura et al. 1998），一般需要花費較多的時間。后者需要較多的待分離基因的突變體，只要鑒定出所分離的基因在所有的突變體中也發(fā)生了突變，就可認(rèn)為所分離的基因是目的基因（Buschges et al. 1997）。

圖位克隆法一般僅適用于小基因組植物。大基因組的物種，由于物理距離和遺傳距離之比很大，不利于染色體的步移。而第一步若能將基因限定于一個非常狹小的區(qū)域，將極大地減少物理圖譜構(gòu)建的工作量，并且有利于進一步用小片段的基因組文庫覆蓋該區(qū)域，迅速確定候選基因。要知道，從一個長幾百或上百kb的YAC或BAC克隆中找到目標(biāo)基因，仍有一段漫長路要走。對于克隆那些結(jié)構(gòu)性質(zhì)一無所知的基因，有時一個YAC或BAC含有多個開放讀碼框（ORF），所有的這些ORF都做互補實驗，工作量是十分巨大的。這樣，若第一步的工作做細(xì)，就可將目標(biāo)基因限定在一個或少數(shù)幾個ORF上，就能迅速獲得基因。用圖位克隆法克隆基因是非常耗時、費力的工作，并需要足夠經(jīng)濟支持。即使對水稻這樣的小基因組作物（平均1cM相當(dāng)于260 Kb; Wu & Tankey, 1993），已構(gòu)建了多張高密度分子標(biāo)記連鎖圖（Causse et al., 1994, Harushima Y et al., 1998）和多個大片段基因組文庫。要克隆一個基因，工作量仍是驚人的。

從圖位克隆法克隆基因的過程，可看出此法的局限性：
（1）僅適合于小基因組物種；
（2）工作量巨大；
（3）目的基因區(qū)域的精細(xì)遺傳圖譜的完成是圖位克隆的前提；
（4）必須構(gòu)建多種文庫（基因組文庫、cDNA文庫等）；
（5）必須有連鎖非常緊密的分子標(biāo)記；
（6）目的基因所控制的性狀必須容易識別，受環(huán)境因素影響小。