1. Author
夏寧邵是中國著名的生物醫(yī)學(xué)專家，主要從事疫苗和診斷試劑的研發(fā)工作。他是廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院的教授，并擔(dān)任國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心的主任。夏寧邵教授在疫苗研發(fā)領(lǐng)域取得了多項(xiàng)重要成果，特別是在乙肝疫苗、宮頸癌疫苗（HPV疫苗）以及新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的診斷試劑和疫苗研發(fā)方面做出了突出貢獻(xiàn)。
夏寧邵教授的研究團(tuán)隊(duì)成功研發(fā)了全球首個(gè)戊型肝炎疫苗（益可寧），并在HPV疫苗的國產(chǎn)化方面取得了重要突破，推動了中國自主創(chuàng)新疫苗的發(fā)展。他的工作不僅提升了中國在疫苗和診斷試劑領(lǐng)域的國際地位，也為全球公共衛(wèi)生事業(yè)作出了重要貢獻(xiàn)。
2. Background
2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）功能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)異常積累的一種細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)。
當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外因素刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致其功能受損，主要表現(xiàn)為：
未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白積累：?這是ER應(yīng)激的核心特征。原因包括：蛋白質(zhì)合成需求激增（如分泌細(xì)胞大量分泌蛋白時(shí)）、蛋白質(zhì)折疊能力下降（如缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激、某些毒素或藥物作用）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境改變（如pH變化、氧化還原狀態(tài)改變）、基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)本身難以正確折疊。
鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡：?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是主要的鈣庫，鈣離子濃度變化影響許多伴侶蛋白的活性。
氧化還原狀態(tài)失衡：?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是氧化環(huán)境，對二硫鍵形成至關(guān)重要，氧化應(yīng)激會干擾蛋白質(zhì)折疊。
脂質(zhì)代謝紊亂：?脂質(zhì)合成異?；蝻柡椭舅岱e累也會誘發(fā)ER應(yīng)激。
如果ER應(yīng)激過于嚴(yán)重或持續(xù)時(shí)間過長，超出了細(xì)胞的代償能力，會轉(zhuǎn)而激活凋亡程序，清除功能嚴(yán)重受損的細(xì)胞。這是防止損傷擴(kuò)散的重要機(jī)制。神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、心血管疾病、癌癥、炎癥性疾病、肝病等）發(fā)生發(fā)展的核心病理機(jī)制之一。
2.2 羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)
CFSE檢測細(xì)胞增殖的原理?核心在于利用熒光染料的可逆性稀釋來追蹤細(xì)胞分裂的世代數(shù)。CFSE是一種非極性、膜通透性的熒光染料（通常發(fā)出綠色熒光）。當(dāng)將CFSE加入細(xì)胞懸液時(shí)，它能被動擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞胞質(zhì)。在胞質(zhì)內(nèi)，CFSE的琥珀酰亞胺酯基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)的游離氨基（主要存在于賴氨酸殘基和其他胞內(nèi)蛋白上）發(fā)生不可逆的共價(jià)結(jié)合反應(yīng)。這一步將熒光染料永久性地“錨定”在細(xì)胞內(nèi)。
2.3 乙肝病毒抗原
3. Methods
名為E6F6-B的小鼠模型經(jīng)工程改造可以特異性表達(dá)識別HBsAg的B細(xì)胞受體（BCR）。該模型作為一個(gè)有價(jià)值的工具，用于研究連續(xù)抗原刺激下接種疫苗后個(gè)體體液免疫的動態(tài)變化。利用這樣一套免疫學(xué)工具，作者闡明了HBV攜帶小鼠接種疫苗后的HBeAg特異性B細(xì)胞的分化軌跡。
4. Results
4.1 E6F6抗體的敲入小鼠構(gòu)建與病原特異性B細(xì)胞的研究
基于先前的研究，將E6F6的整個(gè)κ鏈和重鏈可變區(qū)的序列敲入C57BL/6小鼠的受精卵母細(xì)胞中，替換內(nèi)源性重鏈等位基因J1-J4。該小鼠所得B細(xì)胞表達(dá)由E6F6可變區(qū)和內(nèi)源性類別轉(zhuǎn)換恒定區(qū)。在后續(xù)的流式結(jié)果表明，該基因小鼠現(xiàn)出約40%的HBsAg結(jié)合效率，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了評估治療疫苗給藥后E6F6-B細(xì)胞的反應(yīng)，將E6F6-B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到C57BL/B6小鼠中，隨后用CRT3-SEQ13對此進(jìn)行了免疫。在CRT3-SEQ13疫苗接種后WT小鼠中觀察到E6F6-B細(xì)胞的明顯激活和增殖。 在持續(xù)的抗原刺激下，B細(xì)胞呈現(xiàn)出減弱的跡象。E6F6-B細(xì)胞在GC內(nèi)進(jìn)行了增殖，標(biāo)志著顯著的Ki67表達(dá)。為了研究治療性疫苗接種后周圍HBSAG的潛在免疫抑制作用，BCR測序表明E6F6B的體細(xì)胞超數(shù)被抑制，這表明E6F6-B細(xì)胞在長期感染的小鼠中的親和力成熟較少。
4.2 慢性感染中抗體分泌細(xì)胞數(shù)量呈下降趨勢
過量的外圍HBsAg會影響抗原特異性B細(xì)胞的早期激活； 但是，持續(xù)的抗原刺激對疫苗誘導(dǎo)的體液反應(yīng)的分化軌跡的影響研究仍然較少。實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)根據(jù)文獻(xiàn)所展示的Timeline進(jìn)行了細(xì)胞回輸、疫苗注射。發(fā)現(xiàn)外周抗原在0-34天呈現(xiàn)一個(gè)下降的事態(tài)，但是隨后逐漸回升。這樣的現(xiàn)象在臨床病人的身上得到了復(fù)現(xiàn)。除此以外，WT小鼠抗體與病原的變化與AAV-HBS模型有著明顯的變化，為了進(jìn)一步研究變化的情況，作者對治療性疫苗接種慢性HBV感染期間GC反應(yīng)的進(jìn)行了動力學(xué)研究。對于生發(fā)中心的B細(xì)胞而言，WT小鼠的細(xì)胞峰值出現(xiàn)在第六天，而HBV感染模型的小鼠E6F6細(xì)胞峰值出現(xiàn)在第13天。同樣的趨勢同樣存在于漿細(xì)胞中。但是值得一提的是，HBV感染模型漿細(xì)胞在第20天幾乎檢測不到。
實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)在存在持續(xù)的抗原刺激的情況下，發(fā)現(xiàn)在第6天和第20天，TFH細(xì)胞的數(shù)量顯著降低為了研究額外的TFH幫助是否可以在CRT3-SEQ13-OT II免疫后幫助E6F6-B細(xì)胞執(zhí)行功能。結(jié)果顯示，在TFH的幫助下雖然滴度會略高，但是下降的幅度會高于未幫助組，回彈以后趨于同一水平，為此得出結(jié)論：僅額外的T細(xì)胞幫助不足以減輕慢性感染期間抗體的減少。
4.3 慢性HBV感染期間E6F6-B細(xì)胞體液反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄譜
為了從機(jī)制層面研究這種抗原持續(xù)存在對特異性B細(xì)胞的影響，對來自AAV-HBV和WT小鼠的iLN的E6F6-B細(xì)胞上進(jìn)行bulk RNA測序。主成分分析表明，第13天來自AAV-HBV小鼠的E6F6-B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜圖與較早時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存在顯著差異。對13天的樣品進(jìn)行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)富集了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激，細(xì)胞凋亡和BCR信號與基因表達(dá)相關(guān)的基因。為了確定在持續(xù)性抗原刺激過程中E6F6-B細(xì)胞不同轉(zhuǎn)錄組譜的關(guān)鍵因素，在所有時(shí)間點(diǎn)都在所有時(shí)間點(diǎn)評估AAV-HBV和WT小鼠之間重疊的差異基因。發(fā)現(xiàn)主要與蛋白質(zhì)加工，凋亡，漿細(xì)胞分化有關(guān)。那么我們自然想到持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力可能是抗體迅速降低的關(guān)鍵因素，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)評估了凋亡標(biāo)記，該標(biāo)記證實(shí)了它們在慢性感染過程中在E6F6-B細(xì)胞中的表達(dá)升高。為了精確到具體哪些細(xì)胞亞群經(jīng)歷了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)首先將動物模型精確到特異性表達(dá)HBsAg的小鼠——ALB-sHBs小鼠。ALB體內(nèi)的抗原滴度是AAV-HBV 100倍。接下來，進(jìn)行了對B細(xì)胞反應(yīng)治療疫苗接種作用的動力學(xué)研究。 GC反應(yīng)在第13天達(dá)到峰值，隨后PC急劇下降，這與在AAV-HBV小鼠中觀察到的相似。值得強(qiáng)調(diào)的是，在Alb模型中，PC的數(shù)量和頻率都明顯低于第13天的WT小鼠。
4.4 非典型PC前分化細(xì)胞依賴于持續(xù)的HBsAg刺激
對注射疫苗第13天的Alb-Shbs和WT小鼠的E6F6B細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-Seq。分為了13個(gè)亞群。其中，21.84％邊緣區(qū)B細(xì)胞（MZB），63.88％的na?ve B細(xì)胞和10.21％naive/active的B細(xì)胞，這些B細(xì)胞分別以CR2，CD79A和FCMR的表達(dá)為特征。共有的細(xì)胞群包括Pre-GC，DZ-GC和LZ-GC B細(xì)胞，PC和記憶B細(xì)胞（MBC）。而在持續(xù)刺激的Alb-Shbs體內(nèi)存在著一群clust11——Atypical Pre PC（CD138 BCMA缺失，BLIMP-1 XBP1高表達(dá)）。對比WT小鼠與ALB-sHBs小鼠的ASC，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在WT小鼠中的傳統(tǒng)PC富集，而在ALB-sHBs小鼠中Atypical Pre PC富集。通過分化軌跡分析，表明這群Atypical? Pre PC可能是通過GC_LZ/G1_C1。
結(jié)合之前所提到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與Atypical Pre PC同時(shí)存在與乙肝病原持續(xù)刺激的機(jī)體內(nèi)，那么我自然想去探究二者潛在的聯(lián)系，對其進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)ALB-sHBs小鼠E6F6 B細(xì)胞富集了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 抗原提呈以及凋亡相關(guān)基因。同時(shí)，他們實(shí)驗(yàn)室用了自己構(gòu)建的平臺評估了抗體分泌情況，發(fā)現(xiàn)在慢性感染的模型中，抗體分泌也是顯著減少的。
4.5 聯(lián)合治療策略可以部分克服PC分化的異常
為了減輕過量抗原的持續(xù)負(fù)擔(dān)，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)采取了一種疫苗和抗體聯(lián)合治療的策略。先用抗體治療111天，然后過繼轉(zhuǎn)移E6F6 B細(xì)胞后免疫疫苗。發(fā)現(xiàn)這種辦法可以有效的抑制血清中抗原的量。同時(shí)在后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)也可以檢測到乙肝特異性的抗體。這個(gè)提示我們減少外周的乙肝病原刺激，有助于后續(xù)的B細(xì)胞活化，發(fā)揮生物學(xué)功能。為了檢測這種疫苗和抗體聯(lián)合治療的策略的可行性，實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)收集了13天腹股溝淋巴結(jié)的E6F6特異性B細(xì)胞，并按照途中時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行抗體給藥，細(xì)胞回輸以及疫苗注射。在抗體給藥階段，E6F6來源的漿細(xì)胞含量是增加的，而Atypical Pre PC減少。 總的來說，Atypical Pre PC的細(xì)胞頻率與是否注射疫苗呈負(fù)相關(guān)，簡單來越少的Atypical Pre PC，對應(yīng)了更好的病原清除。
5. Discussion
作者：Ruoyao Qi
通訊作者：Ningshao Xia
單位：State Key Laboratory ofVaccines for Infectious Diseases
年份：2023.3.4
期刊：Journal of Hepatology
科學(xué)問題 ：通過開發(fā)新型B細(xì)胞追蹤工具，闡明慢性HBV感染期間HBsAg特異性B細(xì)胞的分化軌跡和命運(yùn)。
討論：本研究通過一種新開發(fā)的HBV抗原特異性BCR基因敲入小鼠模型，描繪了慢性HBV感染過程中抗原特異性B細(xì)胞的分化軌跡。值得一提的是，單獨(dú)de CRT 3-SEQ 13可以誘導(dǎo)E6F6和E6F6樣抗體的產(chǎn)生，這表明該治療性疫苗可以在沒有細(xì)胞回輸?shù)那闆r下引起E6F6-B細(xì)胞的分化。我們的研究結(jié)果揭示了一個(gè)非典型的前PC位于LZ-GC B細(xì)胞和PC的分化軌跡之中。這些具有BCR/CD 40信號傳導(dǎo)缺失的非典型前體細(xì)胞可能是HBV治療性疫苗療效有限的原因。
慢性感染已被證明會損害抗原特異性體液應(yīng)答，而Tfh細(xì)胞缺乏是與這種現(xiàn)象最相關(guān)的因素。在腸道沙門氏菌感染中，病原體誘導(dǎo)IL-12產(chǎn)生，并導(dǎo)致Tfh細(xì)胞和GC的抑制。在瘧疾中，誘導(dǎo)前體Tfh細(xì)胞，其表現(xiàn)出低水平的PD-1和CXCR
5表達(dá)，Th 1相關(guān)標(biāo)志物（如T-bet和CXCR 3）的表達(dá)升高。HIV感染誘導(dǎo)更高頻率的PD-L1+ GC B細(xì)胞，導(dǎo)致與Tfh細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，隨后細(xì)胞增殖、活化和IL-21分泌減少。此外，樹突細(xì)胞早期暴露于I型IFN已顯示通過IL-6產(chǎn)生誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞極化，而晚期暴露于I型IFN在缺乏IL-6產(chǎn)生的情況下促進(jìn)Th 1細(xì)胞分化。相反，我們的研究揭示了典型的Tfh標(biāo)記基因，如PD 1，CXCR 5和BCL 6，在所有檢查的時(shí)間點(diǎn)，在健康和慢性感染小鼠之間沒有表現(xiàn)出顯著差異。有趣的是，Tfh的細(xì)胞計(jì)數(shù)在第13天沒有顯示出顯著差異，這表明Tfh細(xì)胞幫助在HBsAg刺激的峰值時(shí)可能基本上保持完整。然而，E6 F6-B細(xì)胞上不存在CD 40，從而避開了通常由Tfh細(xì)胞提供的共刺激信號。從涉及E6F6-B細(xì)胞和OT II T細(xì)胞的共轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，持續(xù)的BCR信號誘導(dǎo)的B細(xì)胞功能障礙是本研究中引起體液應(yīng)答異常的主要因素。
關(guān)于B細(xì)胞功能障礙，據(jù)報(bào)道，鼠埃里希體和伯氏疏螺旋體感染導(dǎo)致形成短壽命的ASC。已經(jīng)顯示I型IFN信號傳導(dǎo)使na?ve B細(xì)胞傾向于變成短壽命的ASC，并且已經(jīng)證明疫苗誘導(dǎo)的Tfh細(xì)胞拯救PC形成。此外，諸如淋巴組織結(jié)構(gòu)破壞、和濾泡外抗體產(chǎn)生都被報(bào)道與持續(xù)感染有關(guān)。在這里，我們已經(jīng)確定了一類新的功能失調(diào)的B細(xì)胞稱為非典型前PC。與典型PC相比，這些細(xì)胞經(jīng)歷了無序的分化過程，在接種后的最初一周期間，B細(xì)胞活化和GC分化都受到抑制。然而，在接種后第13天，檢測到E6 F6 B細(xì)胞的大量增殖，我們目前缺乏確切的解釋。最初，我們推測疫苗誘導(dǎo)的HBsAg清除是GC增殖延遲的原因。然而，在ALB-sHBs小鼠模型中，其中過量抗原負(fù)荷不能通過疫苗接種抑制，GC應(yīng)答仍在第13天達(dá)到其頂點(diǎn)。此外，在非典型前PC中觀察到BLIMP-1表達(dá)升高，而沒有明顯的ELL 2表達(dá)，這可能有助于ER內(nèi)的抗體保留。在ALB-sHBs小鼠模型中很少檢測到GC的解剖結(jié)構(gòu)，表明可能存在濾泡外GC反應(yīng)。
我們研究的一個(gè)主要局限性是，這種中間狀態(tài)PC亞群的存在尚未在CHB患者的樣本中得到證實(shí)。解決這個(gè)問題提出了兩個(gè)解釋：首先，在沒有接種疫苗的情況下，HBsAg特異性B細(xì)胞占人外周血單核細(xì)胞中總CD 19+細(xì)胞的不到0.1%，因此難以獲得足夠的B細(xì)胞進(jìn)行全面分析。第二，前PC易于凋亡，表明其檢測的時(shí)間窗口有限。因此，確認(rèn)人類樣本中存在這種非典型前PC群體將需要在我們的治療性HBV候選疫苗的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行調(diào)查。另一個(gè)限制是在我們的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中復(fù)制HBsAg對幼稚B細(xì)胞的影響的挑戰(zhàn)。在由CRT
3-SEQ 13引發(fā)的體液應(yīng)答的自然過程中，高親和力E6 F6抗體表達(dá)B細(xì)胞在疫苗施用后約6天遇到HBsAg。該時(shí)間軸對應(yīng)于親和力成熟所需的典型持續(xù)時(shí)間。因此，高親和力HBsAg特異性B細(xì)胞在接種疫苗后不會長時(shí)間暴露于大量HBsAg。HBsAg的長期暴露主要發(fā)生在幼稚B細(xì)胞中，這是因?yàn)樵摷?xì)胞群大約每隔幾周就會不斷補(bǔ)充。不幸的是，HBsAg對幼稚B細(xì)胞的干擾在我們的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中不可行地復(fù)制。值得注意的是，在其他基于轉(zhuǎn)移的情況下也會遇到這種限制，例如涉及艾滋病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒和流感等病原體的情況。
在慢性HBV感染的個(gè)體中，HBsAg特異性CD4+T細(xì)胞的存在是罕見的，并且當(dāng)存在時(shí)，它們的功能通常受損。在慢性HBV的背景下，缺陷可能更多地存在于CD40L而不是CD40的領(lǐng)域。在這項(xiàng)研究中，我們通過揭示PC成熟過程中的一個(gè)特定亞組（稱為“非典型前PC”）擴(kuò)展了這一理論，該亞組在慢性HBV感染期間治療性疫苗接種后完全不表達(dá)CD40 mRNA。值得注意的是，所采用的模型都沒有定量的抗原特異性Tfh應(yīng)答，需要進(jìn)一步研究抗原特異性輔助T細(xì)胞功能。
此外，從AAV-HBV小鼠模型過渡到ALB-sHBs模型的決定源于兩個(gè)主要考慮因素。首先，HBeAg和HBX在形成HBV慢性感染的耐受表型中發(fā)揮作用是公認(rèn)的。為了消除這些因素的影響，我們選擇了HBsAg表達(dá)模型。其次，在ALB-sHBs模型中，非典型前PC群體的顯著性在頻率和細(xì)胞計(jì)數(shù)方面都更明顯。相比之下，在AAVHBV小鼠模型中獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于這些評估顯著更具挑戰(zhàn)性。值得注意的是，與AAV-HBV模型不同，ALB-sHB小鼠模型代表了HBsAg耐受性模型，因?yàn)镠BsAg在整個(gè)動物發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)。因此，兩種模型之間的CD 4 T細(xì)胞特異性（分子內(nèi)）的可用性有根本的不同。
在這項(xiàng)研究中，我們調(diào)查了在治療性疫苗接種過程中的慢性感染的背景下，在時(shí)間順序的方式，這是以前沒有報(bào)道過的HBsAg特異性B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。我們的研究結(jié)果表明，抗原特異性B細(xì)胞具有在B細(xì)胞卵泡內(nèi)建立GC的能力，并在免疫后的初始階段，在健康和慢性感染小鼠中分化為PC和MBC。盡管如此，非常出乎意料的是，在免疫后，抗原特異性GC和中和抗體的水平從第13天到第20天顯著下降。通過RNA測序，我們發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)非典型的前PC的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄譜。在慢性感染期間給予治療性疫苗接種后，抗原特異性B細(xì)胞分化為短壽命、易發(fā)生增殖、非典型前PC。我們推測，這可能是慢性感染持續(xù)存在和未解決狀態(tài)背后的根本原因，這是正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中觀察到的挑戰(zhàn)。為了抵消非典型前PC的形成，我們證明了通過治療性抗體減少BCR信號傳導(dǎo)被證明是重振HBsAg特異性B細(xì)胞應(yīng)答的有效策略。因此，雞尾酒療法或策略性設(shè)計(jì)的疫苗，規(guī)避非典型前PC的產(chǎn)生，有希望開辟新的途徑，為慢性乙型肝炎感染的管理。
