姓名：祝雙 ?? 學號：16040520067

文章轉(zhuǎn)載自https://www.ithome.com/html/discovery/328710.htm：新浪科技作者：晨風/悠悠責編：守一

【嵌牛導讀】：北京時間10月4日消息，據(jù)國外媒體報道，諾貝爾化學獎剛剛揭曉！2017年諾貝爾化學獎授予雅克·杜邦內(nèi)特（Jacques Dubochet），約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他們“在開發(fā)用于溶液中生物分子高分辨率結(jié)構(gòu)測定的冷凍電鏡技術(shù)方面的貢獻”。

【嵌牛鼻子】：化學，原子

【嵌牛提問】：原子層面的生物化學研究有何現(xiàn)實意義

【嵌牛正文】：

他們在原子層面看清了生命的本質(zhì)

2017年的諾貝爾化學獎授予雅克·杜邦內(nèi)特（Jacques Dubochet），約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank），以及理查德·亨德森（Richard Henderson），以表彰他們“在開發(fā)用于溶液中生物分子高分辨率結(jié)構(gòu)測定的冷凍電鏡技術(shù)方面的貢獻”。這是一種呈現(xiàn)生物分子三維立體圖像的技術(shù)方法。使用冷凍電鏡技術(shù)，研究人員能夠?qū)⑦\動中的生物分子進行冷凍，并在原子層面上進行高分辨率成像。這項技術(shù)將生物化學帶入了一個嶄新時代。

圖一：過去幾年間，科學家陸續(xù)發(fā)布了多種復雜蛋白質(zhì)復合體的原子結(jié)構(gòu)。a。一種控制晝夜節(jié)律的蛋白質(zhì)復合體。b。一種可感知耳中壓力變化、使我們聽到聲音的感應器。c。寨卡病毒。

在過去的數(shù)年間，大量令人驚嘆的分子結(jié)構(gòu)充斥著各類文獻（如圖一）：沙門氏菌用于侵襲細胞的注射端；導致化療以及抗生素失效的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖；以及掌管生物晝夜節(jié)律的復雜分子結(jié)構(gòu)等等。這里所展示的還只不過是冷凍電鏡技術(shù)（cryo-EM）應用領(lǐng)域內(nèi)很少的案例。當研究人員開始懷疑寨卡病毒和發(fā)生在巴西境內(nèi)導致大量新生兒出現(xiàn)大腦損傷的“小頭癥”有關(guān)聯(lián)時，他們利用冷凍電鏡技術(shù)對病毒進行了直接成像。在短短數(shù)月內(nèi)，原子層面分辨率的寨卡病毒的立體三維圖像便產(chǎn)生出來了，科學家們基于這些成果迅速研發(fā)相應藥物。

雅克·杜邦內(nèi)特、約阿希姆·弗蘭克以及理查德·亨德森的突破性貢獻讓冷凍電鏡技術(shù)得以成為現(xiàn)實。這項技術(shù)將生物化學技術(shù)帶入了一個嶄新的時，讓科學家們獲取高分辨率生物分子圖像變得前所未有的容易。

圖像是知識的載體和基礎(chǔ)。在20世紀上半葉，生物分子——比如說蛋白質(zhì)，DNA以及RNA都是生物化學地圖上無法填充的空白區(qū)?？茖W家們知道這些物質(zhì)在細胞內(nèi)扮演者關(guān)鍵性作用，但我們無從知曉這些物質(zhì)本身究竟是什么樣的結(jié)構(gòu)。直到1950年代，當英國劍橋大學的科學家們開始探索利用X射線研究蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)時，這一問題才開始嶄露曙光——這是歷史上第一次，人類開始有可能將這些物質(zhì)繁復纏繞的復雜結(jié)構(gòu)用可視化的方式呈現(xiàn)出來。

到了上世紀1980年代，X射線晶體學成像方法得到了核磁共振（NMR）技術(shù)的幫助，用于研究固體狀態(tài)或者溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這項技術(shù)不僅揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，還能研究蛋白質(zhì)的運動及其與其他分子之間的相互作用。正是因為有了這兩種技術(shù)的幫助，我們現(xiàn)在才會有囊括了數(shù)以千計生物分子模型的數(shù)據(jù)庫可以使用，這些數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在被應用在從技術(shù)研究到制藥公司的各行各業(yè)。

然而，這兩種技術(shù)都有著基礎(chǔ)性缺陷。對溶液內(nèi)樣品使用核磁共振技術(shù)對樣品本身有限制，它只能應用于相對較小的蛋白質(zhì)。而X射線晶體學方法要求必須首先將樣品制作為晶體，比如進行低溫凍結(jié)。即便如此，最終拍攝出來的圖像看上去的效果仍然就像早期相機拍出的黑白照片，科學家們很難從這些模糊不清的圖像中提取到關(guān)于蛋白質(zhì)動態(tài)下的有價值信息。

另外，很多分子是很難制備成晶體樣本的，這一缺陷最終讓理查德·亨德森在1970年代下決心放棄X射線晶體學方法——而這，正是今年諾貝爾化學獎獲獎成果故事的開端。

亨德森另辟蹊徑

理查德·亨德森在英國劍橋大學獲得X射線晶體學領(lǐng)域的博士學位。他利用這種方法對蛋白質(zhì)進行成像，但是當他嘗試對一種自然地內(nèi)嵌于細胞膜上的蛋白質(zhì)進行晶體制備時，卻遭遇到巨大困難。膜蛋白難以操控。它們一旦離開原有的自然環(huán)境，也就是細胞膜之后，它們就會萎縮成一團毫無用處的物質(zhì)。

理查德·亨德森嘗試成像的第一種膜蛋白難以制備足夠用量的樣本，而第二種膜蛋白則難以結(jié)晶。在經(jīng)過數(shù)年的徒勞沮喪之后，亨德森開始嘗試他最后的一種“殺手锏”——電子顯微鏡。在當時，電子顯微鏡是否真的能夠在這一領(lǐng)域使用仍然是一個有爭議的話題。這項技術(shù)被稱為透射電鏡，其原理或多或少與傳統(tǒng)的顯微鏡類似，不同的只是會有一束電子束流射向樣品，而不是傳統(tǒng)顯微鏡那樣是一束光線。

電子的波長遠小于光子，因此電子顯微鏡能夠分辨非常微小的結(jié)構(gòu)——甚至是單個的原子。理論上講，電子顯微鏡的分辨率要滿足亨德森拍攝膜蛋白結(jié)構(gòu)的需求是綽綽有余的，但是在現(xiàn)實中，這一目標卻幾乎是無法實現(xiàn)的。

當電子顯微鏡在1930年代被最早發(fā)明出來時，科學家們認為其只適合對“死的”物質(zhì)進行研究。獲得高分辨率圖像所需的強烈電子束流會破壞生物材料樣品，而如果降低電子束流強度，成像質(zhì)量則會大幅下降。

除此之外，電子顯微鏡需要用到真空腔，而這也不適合應用于生物分子，因為在這樣的環(huán)境下生物分子周圍的水會迅速揮發(fā)掉。而當生物分子干涸時，它們的結(jié)構(gòu)將崩塌，喪失自然結(jié)構(gòu)特征，從而讓成像結(jié)果變得毫無意義。所有這一切幾乎都在告訴亨德森，他的大膽嘗試注定將要失敗。但是，他的嘗試卻由于他當時選中進行研究的蛋白質(zhì)類型比較特殊而出現(xiàn)了轉(zhuǎn)機，他研究的對象是細菌視紫紅質(zhì)。

這樣還不夠好

細菌視紫紅質(zhì)是一種內(nèi)嵌在光合作用有機體細胞膜上的紫色蛋白質(zhì)，其能夠捕捉太陽光線中的能量。亨德森不再試圖像以前那樣將其從細胞膜上剝離，而是將其直接連同其所在的細胞膜一起放置到電子顯微鏡下進行觀察。由于該蛋白質(zhì)此時仍然處于細胞膜上的自然環(huán)境下，它繼續(xù)保持著自己的自然立體結(jié)構(gòu)。亨德森小組用葡萄糖溶液覆蓋樣本表面以防止其在真空腔內(nèi)干涸。

但是強大的電子束流是一個問題，不過研究組從這種蛋白質(zhì)在細胞膜上內(nèi)嵌方式中獲得了啟發(fā)。他們沒有采用高強度電子束流，而是使用了強度更低的束流。這樣得到的圖像對比度很差，無法分辨單個分子，但研究組利用了一個此前已知的事實，那就是這種蛋白質(zhì)在細胞膜上是規(guī)整排列且朝向一致的。當所有蛋白質(zhì)都發(fā)生同向衍射時，基于衍射模式計算，研究組能夠反推得到更加精細的圖像——這種方法與在X射線晶體學成像技術(shù)中使用的數(shù)學方法是類似的。

圖二：圖為1975年發(fā)布的首個細菌視紫紅質(zhì)粗略模型。圖源《自然》第257期28至32頁。

下一步，研究組將細胞膜樣品再次放置到電子顯微鏡下，從很多不同的角度進行拍攝。通過這種方法，到1975年時他們已經(jīng)能夠得到細菌視紫紅質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)圖像了（圖2）。從圖像中可以清晰觀察到蛋白質(zhì)鏈條是如何在細胞膜上來回穿行的。這是歷史上使用電子顯微鏡獲得的最佳蛋白質(zhì)圖像。很多人對這樣的高分辨率圖像印象深刻（其圖像分辨率達到了7埃水平，相當于0.0000007毫米）。這是一個驚人的成就，但在亨德森看來，這樣的結(jié)果還不夠好。他的目標是達到X射線晶體學成像方法通常能夠達到的分辨率水平——大約3埃左右，并且他堅信利用電子顯微鏡成像技術(shù)，這個目標是可以實現(xiàn)的。

第一張原子層面分辨率圖像

在接下來的數(shù)年間，電子顯微鏡技術(shù)逐漸完善。鏡片質(zhì)量得到了改善，低溫冷凍技術(shù)也有了新的進步。在進行觀察之前，先利用液氮對樣本進行快速冷凍，從而避免其受到電子束流的損傷。得益于這些技術(shù)進步，理查德·亨德森逐漸為她研究的細菌視紫紅質(zhì)蛋白圖像加入更多細節(jié)。為了獲得最佳分辨率，亨德森遍訪世界各地最好的電子顯微鏡設(shè)備。最終，到了1990年，在他發(fā)表第一份細菌視紫紅質(zhì)立體模型整整15年后，亨德森達成了自己當年許下的目標：他對外發(fā)布了分辨率達到原子層面的細菌視紫紅質(zhì)立體圖像（圖三）。

圖三：1990年，亨德森發(fā)布了原子級分辨率的細菌視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)。

通過這些工作，亨德森證明了，利用冷凍電鏡技術(shù)是可以拍攝出分辨率媲美X射線晶體學傳統(tǒng)方法的圖像的。這是一項重要的里程碑。然而，這一成功有一個前提，那就是他選擇的蛋白質(zhì)很特殊，細菌視紫紅質(zhì)是有規(guī)則地內(nèi)嵌在細胞膜上的。但是其他蛋白質(zhì)卻并非如此。

這個問題很重要，因為它決定了這種方法是否具有普適性，是否能夠被推廣應用：科學家們有可能利用電子顯微鏡獲得那些分布上沒有規(guī)律的蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)圖像嗎？亨德森堅信這個問題的答案是肯定的，而他的同行們認為亨德森的想法太過樂觀了。

與此同時，在大西洋的彼岸，紐約州衛(wèi)生署。約阿希姆·弗蘭克也一直在思考著同樣的問題。在1975年，他發(fā)展出一種理論方法，能夠?qū)㈦娮语@微鏡獲得的二維平面模糊圖像進行分析和疊加處理，最終得到更高分辨率的三維立體圖像。但弗蘭克最終花費了超過10年時間才逐漸將這一方法一步步完善。

弗蘭克的圖像分析算法

圖四：弗蘭克生成三維結(jié)構(gòu)的圖像分析法

約阿希姆·弗蘭克的方法（圖四）基本原理是讓計算機去自動分析電子顯微鏡獲得的模糊二維圖像，識別其中的蛋白質(zhì)與周遭背景。他開發(fā)出一套數(shù)學方法，能夠讓計算機識別在圖像中反復出現(xiàn)的模式。隨后計算機將相類似的圖像模式歸類到一起并將這些圖像中的信息進行合并疊加，從而生成更加清晰地圖像。

通過這種方法，弗蘭克獲得了一系列高分辨率的二維圖像。這些圖像展示的是同一種蛋白質(zhì)，但是角度不同。整套算法軟件到1981年終于完成。下一步，弗蘭克必須弄清楚這些不同角度的二維圖像之間是如何相互關(guān)聯(lián)的，基于這些信息，他要嘗試將這些二維圖像合并并構(gòu)建三位立體圖像。弗蘭克在1980年代中期對外發(fā)布了部分他開發(fā)的圖像算法，并基于這一算法發(fā)布了核糖體的表面結(jié)構(gòu)模型，這是一種在細胞內(nèi)的細胞器，主要功能是合成蛋白質(zhì)。

約阿希姆·弗蘭克的圖像處理方法對于冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展是基礎(chǔ)性的。

現(xiàn)在，讓我們把時間再回溯到1978年，此時的弗蘭克正忙于完善他的圖像處理算法軟件，而就在這一年，今年諾貝爾化學獎的第三位獲獎人雅克？？杜邦內(nèi)特被設(shè)在德國海德堡的歐洲分子生物學實驗室錄用了。杜邦內(nèi)特將要解決的是電子顯微鏡領(lǐng)域的另外一個基礎(chǔ)性問題：當被放置于真空腔內(nèi)時，生物樣本是如何干涸并遭到破壞的？

杜邦內(nèi)特的玻璃化方法

1984年杜邦內(nèi)特首次通過玻璃水方法拍攝到樣本周圍的病毒。

在1975年，亨德森使用葡萄糖來保護樣品，防止他的細胞膜樣品干涸。但這種方法不適用于水溶性的生物分子。其他研究者曾經(jīng)嘗試冷凍樣品，因為冰的蒸發(fā)速度要比水慢，但冰的晶體結(jié)構(gòu)會擾亂電子束流，導致產(chǎn)生的圖像是無效的。

水的蒸發(fā)問題讓人為難，然而雅克？？杜邦內(nèi)特卻看到了一個潛在解決方案：快速冷卻水，使其在液態(tài)形式下固化，形成一種玻璃，而不是晶體。

玻璃材料是一種固體材料，但事實上卻是液體，因為它具有混亂無序的分子。杜邦內(nèi)特意識到，如果將水變成玻璃——也叫做“玻璃水”，電子束將均勻衍射，并提供一個標準背景。

最初，研究小組試圖在零下196攝氏度的液氮中玻璃化微小水滴，但一直沒能成功，最后用乙烷代替液氮后才最終實現(xiàn)，而乙烷本身則需要先用液氮來進行冷卻。在顯微鏡下，他們觀察到一種前所未見的情景。他們一開始認為這應該是乙烷，但是當液滴經(jīng)過輕微加熱，其分子卻突然出現(xiàn)重新排列，形成了一種熟悉的冰晶結(jié)構(gòu)。這是一項重要的成就，因為當時很多研究人員認為不可能實現(xiàn)水滴的玻璃化，而現(xiàn)在我們認為，玻璃化的水是宇宙中最常見的水的形式。

一種簡單技術(shù)提升對比度

在1982年取得技術(shù)突破之后，杜邦內(nèi)特的研究小組快速研制一種基礎(chǔ)性技術(shù)，該技術(shù)仍用于冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）。他們將生物樣本制成溶液——期初是不同類型的病毒。這些溶液涂抹在金屬網(wǎng)上形成薄膜。隨后使用一種類似彈弓的結(jié)構(gòu)將其射入液態(tài)乙烷快速冷卻，從而使薄膜水玻璃化。

1984年，杜邦內(nèi)特首次發(fā)布了不同病毒的結(jié)構(gòu)圖像，有圓形，有六邊形。這些圖像中病毒圖像均與背景玻璃水存在清晰反差。到這里為止，生物材料就比較容易通過電子顯微鏡進行觀察了。很快，各地的科學家們便開始前往杜邦內(nèi)特的實驗室學習這項最新的技術(shù)。

從“水滴學”到大變革

冷凍電鏡最重要的問題是拍攝圖像的質(zhì)量較低。1991年，約阿希姆？？弗蘭克使用杜邦內(nèi)特的玻璃化方法成像核糖體，并使用自己的軟件分析這些圖像，他獲得一個分辨率為40？？（？？= 10^-10m）的三維立體圖像。

這是電子顯微鏡領(lǐng)域令人振奮的一項突破，但是圖像僅能顯示核糖體輪廓。坦白地講，它更像一團色塊，分辨率上完全不能與X射線晶體學的原子級分辨率相提并論。

由于冷凍電鏡除了觀察不平整的表面之外，罕有用武之地，因此這種方法有時被嘲笑是“只能看見一坨東西的技術(shù)”（blobology）。

然而，很大程度上是由于理查德·亨德森堅信有朝一日電子顯微鏡將能夠提供原子層面分辨率的圖像并不斷進行著嘗試，電子顯微鏡技術(shù)經(jīng)歷著不斷進步，它的分辨率正一埃一埃地不斷改善，最后一個障礙在2013年被成功突破——一種全新的電子顯微鏡問世了（圖六）。

圖六

洞察細胞的每個隱秘角落

現(xiàn)在，夢想已成現(xiàn)實。我們正面對生物化學領(lǐng)域的爆炸式發(fā)展。冷凍電鏡的諸多優(yōu)勢使其具有了革命性的意義：杜邦內(nèi)特的玻璃化技術(shù)使用相對容易，同時需要的樣本量較少；由于快速冷凍過程，生物分子在過程中凍結(jié)，研究人員拍攝一系列圖像，能夠捕捉到該進程的不同部分。

基于這種方法，他們制造“薄膜”，能夠揭曉蛋白質(zhì)如何移動，以及與其它分子發(fā)生交互。使用冷凍電子顯微鏡，能夠更容易地描述膜蛋白，膜蛋白經(jīng)常作為藥物和較大分子復合物的實驗標靶。然而，較小的蛋白質(zhì)無法在電子顯微鏡下研究，但是它們可以使用核磁共振波譜學或者X射線晶體學進行可視化。

之后約阿希姆·弗蘭克提出了他的普通成像處理技術(shù)策略，他指出，如果這項技術(shù)能夠非常完美，那么對于一位科學家而言，其應用領(lǐng)域是“沒有限制的”。

現(xiàn)在，海闊任魚躍，天高任鳥飛——雅克·杜邦內(nèi)特、約阿希姆·弗蘭克和理查德·亨德森所研發(fā)的這項技術(shù)將帶給人類最大的益處。我們將能夠以原子層面的分辨率洞察細胞的每一個隱秘角落，生物化學將迎來一個光輝的未來！