EffectorP軟件利用機(jī)器學(xué)習(xí)原理，通過事先收集已知的效應(yīng)子制備訓(xùn)練集，從而實(shí)現(xiàn)病原真菌和卵菌的效應(yīng)子預(yù)測[1]。
EffectorP發(fā)展史[2]：
1.0版本最初在16年發(fā)表于NEW PHYTOLOGIST，實(shí)現(xiàn)了機(jī)器學(xué)習(xí)初步預(yù)測效應(yīng)子。
2.0版本在18年發(fā)表于MPP，采用了更大的訓(xùn)練集和模型集成的方法，準(zhǔn)確度更高。
3.0版本在22年發(fā)表于MPMI，是目前最新的版本。其實(shí)現(xiàn)了效應(yīng)子的空間定位預(yù)測，同時新增了對卵菌效應(yīng)子的預(yù)測。
EffectorP3.0正訓(xùn)練集采用64個質(zhì)外體效應(yīng)子（50個真菌效應(yīng)子，14個卵菌效應(yīng)子）和112個胞質(zhì)效應(yīng)子（77真菌，35卵菌）構(gòu)成。負(fù)訓(xùn)練集采用五種不太可能成為effectors的蛋白作為指標(biāo)。正負(fù)訓(xùn)練集中的同源重復(fù)蛋白皆被去除。EffectorP3.0通過構(gòu)建已有效應(yīng)子數(shù)據(jù)庫，訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)模型，實(shí)現(xiàn)效應(yīng)子預(yù)測。同時推斷效應(yīng)子的定位信息。 EffectorP也有在線網(wǎng)站：https://effectorp.csiro.au/ 對代碼不感冒的小伙伴可以參考此網(wǎng)頁。
0.下載并安裝EffectorP
我們首先進(jìn)入EffectorP官網(wǎng)下載最新版本軟件：
$ git clone https://github.com/JanaSperschneider/EffectorP-3.0.git
EffectorP的運(yùn)行需要Python3環(huán)境和WEKA軟件3.8.4版本。需要我們提前在服務(wù)器上配置好。新建python3環(huán)境可以用conda實(shí)現(xiàn)。
#新建python3環(huán)境
$ conda create -y -n effector python=3
$ conda activate effector
#配置WEKA3.8.4，簡單解壓即可。
$ cd EffectorP-3.0-main && unzip weka-3-8-4.zip
通過軟件自帶的蛋白序列測試數(shù)據(jù)Effectors.fasta，測試是否運(yùn)行順利：
$ python EffectorP.py -i Effectors.fasta
#若成功運(yùn)行則會在屏幕輸出預(yù)測結(jié)果
我們可以參考官網(wǎng)給出的結(jié)果示例：
python EffectorP.py -i Effectors.fasta
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EffectorP 3.0 is running for 9 proteins given in FASTA file Effectors.fasta
Ensemble classification
25 percent done...
50 percent done...
75 percent done...
All done.
# Identifier Cytoplasmic effector Apoplastic effector Non-effector Prediction
AvrM Melampsora lini Y (1.0) - - Cytoplasmic effector
Avr1-CO39 Magnaporthe oryzae Y (0.945) Y (0.667) - Cytoplasmic/apoplastic effector
ToxA Parastagonospora nodorum Y (0.551) Y (0.767) - Apoplastic/cytoplasmic effector
AVR3a Phytophthora infestans Y (0.985) - - Cytoplasmic effector
Pit2 Ustilago maydis Y (0.779) - - Cytoplasmic effector
Zt6 Zymoseptoria tritici - Y (0.944) - Apoplastic effector
INF1 Phytophthora infestans - Y (0.837) - Apoplastic effector
Zinc transporter 3 Arabidopsis thaliana - - Y (0.737) Non-effector
GPI-anchored protein 13 Candida albicans - - Y (0.708) Non-effector
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9 proteins were provided as input in the following file: Effectors.fasta
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Number of predicted effectors: 7
Number of predicted cytoplasmic effectors: 4
Number of predicted apoplastic effectors: 3
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77.8 percent are predicted effectors.
44.4 percent are predicted cytoplasmic effectors.
33.3 percent are predicted apoplastic effectors.
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可見，EffectorP非常直觀地給出了各個蛋白的預(yù)測類型（是/否為效應(yīng)子）以及這些蛋白可能存在的細(xì)胞位置！
下面我們將采用發(fā)表于NCBI的稻瘟菌RNA-seq作為示例數(shù)據(jù)，執(zhí)行批量預(yù)測效應(yīng)子的操作。稻瘟菌RNA-seq的sra編號分別為SRR081552,SRR081553,SRR081554,SRR081555,SRR081556。
1.批量下載及解壓sra示例數(shù)據(jù)
首先將示例數(shù)據(jù)的sra序號存放到新的文本文件sra.txt中，執(zhí)行下載和批量解壓操作。
$ vim sra.txt
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SRR081552
SRR081553
SRR081554
SRR081555
SRR081556
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#批量下載sra.txt中的數(shù)據(jù)
$ prefetch --option-file sra.txt
下載后的SRR文件需要進(jìn)一步解壓才能得到fastq文件：
#構(gòu)建批量解壓腳本
$ vim step1_fastdump.sh
----------
#!/bin/sh
for i in `tail -n+1 sra.txt|cut -f1`;do
fastq-dump ${i} --split-3 --gzip -O ./
done
---------
#執(zhí)行批量解壓處理
$ sh step1_fastdump.sh
2.批量進(jìn)行RNAseq數(shù)據(jù)的回比
將得到的雙端測序數(shù)據(jù)/單端測序數(shù)據(jù)回比到參考基因組上，通過stringtie提取轉(zhuǎn)錄本cds序列。示例數(shù)據(jù)為雙端測序數(shù)據(jù)，故采用雙端測序數(shù)據(jù)的回比流程，此處串聯(lián)成了批量執(zhí)行腳本。
針對雙端測序的批量執(zhí)行腳本。
#構(gòu)建批量處理腳本
$ vim step2_hisat2_pair.sh
----------
#!/bin/bash
for i in `tail -n+1 sra.txt|cut -f1`;do
{
hisat2 -p 8 --dta --no-mixed --no-discordant -x 70-15.BAC.fa -1 ${i}_1.fastq.cleandata.gz -2 ${i}_2.fastq.cleandata.gz --no-unal -S ${i}.sam 2>${i}.summary.txt
samtools view -bS ${i}.sam -o ${i}.bam
samtools sort ${i}.bam ${i}.sorted.bam #注意產(chǎn)生的是SRR081556.sorted.bam.bam
stringtie ${i}.sorted.bam.bam -p 20 -o ${i}.gtf
gffread -w ${i}.fa -g 70-15.BAC.fa ${i}.gtf
}
done
---------
#批量處理
$ sh step2_hisat2_pair.sh
針對單端測序的批量執(zhí)行腳本。
#構(gòu)建批量處理腳本
$ vim step2_hisat2_single.sh
----------
#!/bin/bash
for i in `tail -n+1 sra.txt|cut -f1`;do
{
hisat2 -p 8 --dta --no-mixed --no-discordant -x 70-15.BAC.fa -U ${i}.fastq.cleandata.gz --no-unal -S ${i}.sam 2>${i}.summary.txt
samtools view -bS ${i}.sam -o ${i}.bam
samtools sort ${i}.bam -o ${i}.sorted.bam #注意產(chǎn)生的是SRR081556.sorted.bam.bam
stringtie ${i}.sorted.bam -p 20 -o ${i}.gtf
gffread -w ${i}.fa -g 70-15.BAC.fa ${i}.gtf
}
done
----------
#執(zhí)行批量處理
$ sh step2_hisat2_single.sh
3.蛋白質(zhì)翻譯和過濾
對回比上的cds序列進(jìn)行翻譯，并篩選100個AA以上的氨基酸作為候選目標(biāo)。
#構(gòu)建批量處理腳本
$ vim step3_translate.sh
----------
#!/bin/bash
for i in `tail -n+1 sra.txt|cut -f1`;do
{
seqkit translate ${i}.fa --trim > ${i}.pro.fa
seqkit seq -m 100 -g ${i}.pro.fa > ${i}.pro.filter.fa
}
done
----------
#批量處理
$ sh step3_translate.sh
4.效應(yīng)子預(yù)測
最后一步，對所有候選的目標(biāo)蛋白進(jìn)行效應(yīng)子預(yù)測。
#構(gòu)建批量處理腳本
$ vim step4_effectorP.sh
----------
#!/bin/bash
for i in `tail -n+1 sra.txt|cut -f1`;do
{
python /mnt/zhou/hangyuan/biosoft/EffectorP-3.0-main/EffectorP.py -i ${i}.pro.filter.fa > ${i}.predict_effector.txt
}
done
----------
#批量處理
$ sh step4_effectorP.sh
執(zhí)行后完上述所有代碼后，得到的預(yù)測結(jié)果文件會分別保存在以.predict_effector.txt為結(jié)尾的文本文件中。打開即可查看各個RNAseq數(shù)據(jù)的預(yù)測結(jié)果。
參考信息：
- EffectorP Github：https://github.com/JanaSperschneider/EffectorP-3.0
- Sperschneider J, Dodds P. EffectorP 3.0: prediction of apoplastic and cytoplasmic effectors in fungi and oomycetes. Mol Plant Microbe Interact. 2021.doi: 10.1094/MPMI-08-21-0201-R
