Treg細(xì)胞是腫瘤中主要的免疫抑制細(xì)胞，是免疫治療的潛在靶點。但針對腫瘤浸潤（TI）Treg的免疫治療效果不確切。這篇文章里作者對三例ccRCC患者的外周血和腫瘤中的Treg進行了單細(xì)胞測序，鑒定出了不同功能的TI Treg亞群，發(fā)現(xiàn)CD177+ TI Treg細(xì)胞群可能作為TI Treg特異性免疫治療靶點。
1. 單細(xì)胞測序分析ccRCC病人的TI Treg細(xì)胞
作者對13433個外周血細(xì)胞和12239個TI細(xì)胞進行了測序，從中鑒定出了160個PB Treg和574個TI Treg。作者隨后比較了TI versus PB Treg的差異基因，做了火山圖（畫法見：單細(xì)胞亞群差異基因火山圖）和top基因的條圖。作者還使用了另外一個最近發(fā)表的HCC中T細(xì)胞的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)集，對PB和TI Treg做了差異分析，得到467差異基因。和前面得到的ccRCC病人的差異基因取交集，得到143個基因。最后作者展示了一些交集差異基因的小提琴圖。在這些基因中，CD177在兩個癌腫的TI Treg中l(wèi)ogFC都是最高的 (ccRCC 4.86, HCC 4.55)。
Treg細(xì)胞的marker基因：FOXP3和CD25/IL2RA。參考：T細(xì)胞注釋
2. The transcriptional bifurcation of TI Treg cells.
作者后面的分析都是把自己測的ccRCC和數(shù)據(jù)庫里下載的HCC的PB和TI Treg細(xì)胞在一起分析的。這部分主要是做了monocle2擬時序分析。這個分化軌跡出的挺好的，從PB Treg到TI Treg有明顯的分化過程，而且還分了兩個Cell Fate。一些在分化晚期階段表達的基因比如CCR8, CD177, CCL20和CTLA4也是前面鑒定出來的差異基因。兩個Cell Fate的細(xì)胞存在轉(zhuǎn)錄差異。根據(jù)差異基因分析，作者鑒定出三個基因表達的distinct trends (d圖)，一些基因比如CCR8和CTLA4在兩個cell fate中都沒有高表達，一些基因比如CD177和TNFRSF4 (OX40)在CF1高表達，而一些基因比如CXCR4和EGR1只在CF2中表達。隨后作者對PB, CF1和CF2的細(xì)胞做了GSEA，和PB相比，CF1群細(xì)胞的naive分?jǐn)?shù)下降，耗竭，細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期評分都增加，和CF1的G2M期細(xì)胞比例增加一致。提示CD177+T細(xì)胞 (CF1群) 存在增加的clonality。
3. The suppressive TI Treg subset expresses a gene signature with superior prognostic ability
前面的數(shù)據(jù)顯示TI Treg細(xì)胞亞群存在轉(zhuǎn)錄和功能差異，所以作者想要去探究是否單細(xì)胞數(shù)據(jù)信息可以提供一個具有很好預(yù)后提示作用的gene set。作者從TCGA上下載了一個Kidney Renal Clear Cell (KIRC)數(shù)據(jù)集，這個數(shù)據(jù)集包括533腫瘤樣本和完善的預(yù)后信息。作者從KIRC隊列隨機選了10%的樣本進行了特征選擇來鑒定gene signature。使用的基因包括：143個ccRCC和HCC共有TI Treg差異基因，86個CF2特異性基因，222個CF1特異性基因。這些基因通過了一個
gene filter，以得到和其他ccRCC中的TI細(xì)胞群相比，TI Treg特異性的基因。通過多項式支持向量機，k近鄰，boosted tree classifications和bootstrap aggregating classifications supervised machine-learning models ，作者選擇了一個線性支持向量機（這個方法過擬合的問題最?。?。支持向量機在三個基因集中各挑選出了6個基因（gene signature）。
使用這些gene signature對剩下90%的KIRC樣品進行分析，作者發(fā)現(xiàn)TI Treg signature和CF1 signature可以很好的對病人預(yù)后作區(qū)分，CF2 signature則不行 (b圖)。而且CF1和TI Treg signature對cox hazard ratio比foxp3更好 (c圖)。但是盡管TI Treg 比CF1 signature的hazard ratio更高，CF1 signature在多種腫瘤中對患者預(yù)后的預(yù)測度都很好，TI Treg signature則相對不好(d e圖)。
4. Expression of CD177 is specific to TI-Treg cells in various human solid cancers
CD177是在TI Treg中特異性高表達的 (a-c)，這一點在流式的結(jié)果里也得到了驗證 (d)。CD177+ Treg細(xì)胞占乳腺癌TI Treg的16.8%，占腎癌TI Treg的 16.8%，在T Conv中則表達很少。然后作者想看一下是什么誘導(dǎo)了Treg CD177的體外表達，就做了體外誘導(dǎo)實驗，沒有誘導(dǎo)出來（這是review要求補的實驗吧...）
作者構(gòu)建了Cd177-KO鼠，發(fā)現(xiàn)CD177缺陷的小鼠構(gòu)建Py8119原位乳腺癌模型和MC38結(jié)腸癌模型后腫瘤生長顯著下降。CD177的Treg細(xì)胞特異性清楚的小鼠，腫瘤體積也要顯著減小。
Treg特異性CD177 KO鼠出現(xiàn)了明顯的TI Treg數(shù)量下降(a)。腫瘤中TI效應(yīng)T細(xì)胞(CD4 Tcov或CD8)/Treg的比例也增加(b)，細(xì)胞增殖能力也下降(c)。人類乳腺癌細(xì)胞和MC38腫瘤中CD177-和+并沒有很明顯的趨化因子的變化(d e)，提示CD177可能不是Treg招募進腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。
5. Expression of CD177 in TI Treg cells leads to an increased suppressive activity
后面驗證了一下這群細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞有更強的抑制性，給了CD177的抗體移植效應(yīng)則減輕。
Our study highlights the importance of investigating the heterogeneity of immune cell populations, including Treg cells, in the tumors to improve the understanding of the tumor micro- environment and identify new targets for Treg-based immunotherapy. This data also provides a unique resource of transcriptome data at the single cell level from ccRCC PB and TI immune cells.
