在RNA-seq的分析中，需要對基因或者轉(zhuǎn)錄本的read counts數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化過程。因?yàn)槁湓谝粋€基因區(qū)域內(nèi)的read counts取決于基因長度和測序深度。當(dāng)基因長度越長，測序深度越深，則落在該基因的read counts越多。
當(dāng)進(jìn)行基因差異表達(dá)的分析時，往往是在多個樣本中比較不同基因的表達(dá)量，如果不進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，比較結(jié)果則是沒有意義的。
常用的三種標(biāo)準(zhǔn)化分析是RPKM (Reads Per Kilobase Million)、FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)
為了更清楚的展示計算過程，我們用三個樣本的4個基因的read counts矩陣做例子（來源于YouTube）。如表1：
可以清楚地看到，樣本3的4個基因read counts數(shù)目明顯多于其他兩個樣本，說明其測序深度較高，基因B的長度的基因A的兩倍，也使得其read counts在三個樣本中都高于A。
1、RPKM/FPKM
RPKM和FPKM的計算過程相同，都是先將測序深度標(biāo)準(zhǔn)化，再對基因長度標(biāo)準(zhǔn)化。
第一步：先將測序深度標(biāo)準(zhǔn)化，分別計算出每個樣本的總reads數(shù)（為了使數(shù)值可讀性更好，下面的計算中我們用10代表million），然后將表中數(shù)據(jù)分別除以總reads數(shù)即可，這樣就得到了reads per million. 如下表2：
第二步：基因長度的標(biāo)準(zhǔn)化。將表2的read per million直接除以基因長度即可，如表3：
這里，就算出來RPKM值的結(jié)果，F(xiàn)PKM和RPKM的定義是相同的，唯一的區(qū)別是FPKM適用于雙端測序文庫，而RPKM適用于單端測序文庫。FPKM會將配對比對到一個片段（fragment）上的兩個reads計算一次，接下來的計算過程跟RPKM一樣。
2、TPM
TPM的計算過程與RPKM相反，即先標(biāo)準(zhǔn)化基因長度，再標(biāo)準(zhǔn)化測序深度。仍以表1的那個例子來說明TPM是計算過程。
第一步：直接除以基因長度，得到reads per kilobase，如表4：
第二步：標(biāo)準(zhǔn)化測序深度時，總的reads數(shù)要用第一步中除過基因長度的數(shù)值。即第一樣本除以15，第二個樣本除以20.25，第三個樣本除以45.1 。表5就是TPM的結(jié)果。
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補(bǔ)充：
因?yàn)榭蒲羞^程中需要將counts值轉(zhuǎn)換為FPKM值計算，所以對FPKM這一部分進(jìn)行一下補(bǔ)充
對數(shù)量級的理解
要求出FPKM值，需要獲得三個參數(shù)。
cDNA Fragments：為單個基因比對到基因組上的reads數(shù)，在測序數(shù)據(jù)里就是count值。HTseq處理后可以直接得到的結(jié)果。
Mapped Fragments：指每個樣品中所有基因比對到基因組上的reads數(shù)。也就是用求和函數(shù)sum()將單一樣品的count值全部加起來。注意，由于單位是百萬，所以求和后需要除以10^6。
Transcript Length：也就是exon length，是指reads比對到基因外顯子上的長度。這個需要找到參考基因組才能獲得數(shù)據(jù)。
