2023年7月，上海交通大學(xué)林文慧教授為通訊作者，于世霞博士為第一作者，在生物學(xué)1區(qū)Top期刊Cell Reports(IF=8.8)上發(fā)表了題為“RLI2 regulates Arabidopsis female gametophyte and embryo development by facilitating the assembly of the translational machinery”的文章，文章闡明了在擬南芥中RLI2的沉默會(huì)影響參與翻譯調(diào)控和胚胎發(fā)育的蛋白亞群的翻譯效率，進(jìn)而影響雌配子體和胚胎的發(fā)育，研究結(jié)果表明RIL2促進(jìn)翻譯后的組裝，間接調(diào)控了生長(zhǎng)素信號(hào)以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。
?研究背景 Origingene?
真核生物的翻譯是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程（起始、延伸、終止和核糖體再循環(huán)），需要不同調(diào)控蛋白的參與，翻譯機(jī)制的缺陷通常會(huì)導(dǎo)致胚胎致死率升高或者嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷，RLI2與多種翻譯相關(guān)因子相互作用，調(diào)控細(xì)胞的翻譯過(guò)程。本研究中RIL2/ABCE2蛋白會(huì)顯著影響擬南芥的翻譯效率進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育。實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)擬南芥中RLI2的沉默會(huì)影響參與翻譯調(diào)控和胚胎發(fā)育的蛋白亞群的翻譯效率，進(jìn)而影響雌配子體和胚胎的發(fā)育。研究結(jié)果表明RIL2促進(jìn)翻譯后的組裝，間接調(diào)控了生長(zhǎng)素信號(hào)以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。
ABC蛋白存在于所有生物體中，在配子和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用；ABCE蛋白最初被鑒定為RLI蛋白（RNase L抑制蛋白）；RLI/ABCE在發(fā)育中的作用已在不同物種中被廣泛研究，但在擬南芥中尚未發(fā)現(xiàn)RLI突變體，對(duì)于RLI在配體體發(fā)育、胚胎器官發(fā)生和分生組織形成中的作用尚不清楚。RLI2編碼了一個(gè)擬南芥ABCE蛋白，其在植物發(fā)育中的功能尚未被研究。前人研究表明，參與核糖體生物發(fā)生和翻譯過(guò)程的基因在擬南芥的配子體和胚胎發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用。
在本研究中，研究證明了擬南芥中RLI2是翻譯機(jī)制中的一個(gè)保守因子，對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要，RLI2功能的喪失會(huì)導(dǎo)致配子體和胚胎發(fā)育的停滯，進(jìn)而導(dǎo)致生育能力的降低；通過(guò)RNAi沉默RLI2的擬南芥突變體表現(xiàn)出顯著翻譯缺陷和發(fā)育缺陷；研究借助RNA-seq和4D蛋白組，鑒定了與生長(zhǎng)素相關(guān)基因的模塊基因；研究揭示了RLI2和翻譯機(jī)制間的重要聯(lián)系，對(duì)擬南芥的發(fā)育研究至關(guān)重要。
研究思路 Origingene?
?研究結(jié)果 Origingene?
1.RLI2功能的喪失會(huì)導(dǎo)致其生育能力的降低，RLI2是胚胎和雌配子體發(fā)育的必需基因。
構(gòu)建RLI2缺失突變體rli2-1，由于rli2-1純合子突變體（rli2-1/）不能從rli2-1雜合子植株（rli2-1/+）中分離出來(lái)，但rli2-1/+的育性會(huì)有顯著鑒定，因此本研究對(duì)rli2-1/+進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。野生型的種子發(fā)育良好，但rli2-1/+的角果（有14%白色的種子起皺以及9%角果變小及胚珠皺縮），rli2-1/+的純合體種子胚胎死亡，即無(wú)法獲得rli2-1/的純合體植株。并且通過(guò)對(duì)不同雜交后臺(tái)的分析，發(fā)現(xiàn)rli2-1的雌雄配子體活性均嚴(yán)重降低，而且rli2-1/+胚囊發(fā)育異常包含不規(guī)則分布的核。研究又引入外源RLI2（利用RLI2天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)與mCherry編碼序列融合的RLI2基因組序列，并將該結(jié)構(gòu)體（pRLI2：：RLI2-mCherry）引入rli2-1/+中），外源RLI2的引入緩解了rli2-1/+降低的生育能力和胚胎致死表型。綜上研究證明了RLI2對(duì)擬南芥雌雄配子體和胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。
rli2-1/+胚胎部分表現(xiàn)出異常的細(xì)胞分裂，即細(xì)胞分裂模式受損，導(dǎo)致嚴(yán)重的形態(tài)缺陷和在球狀階段停滯，在早期胚胎模式形成和細(xì)胞分裂均有顯著影響，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察rli2-1/+胚珠不同發(fā)育階段的光學(xué)切片，切片顯示rli2-1/+胚囊在后期的核遷移和液泡形成均受到影響，導(dǎo)致近13%的rli2-1/+胚囊在3-VI階段塌陷，其他胚囊相對(duì)于野生型也有發(fā)育明顯延遲的表現(xiàn)（野生型發(fā)育成7細(xì)胞成熟結(jié)構(gòu)時(shí)，rli2-1/+胚囊只有1-4個(gè)核），進(jìn)一步說(shuō)明了RLI2在雌配子體發(fā)育中起到關(guān)鍵作用。同時(shí)在對(duì)rli2-1/+授粉后進(jìn)行GUS染色和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)約有33%的胚珠無(wú)法誘導(dǎo)花粉產(chǎn)生花粉管，即RLI2的缺失導(dǎo)致胚珠無(wú)法吸引花粉管，進(jìn)而導(dǎo)致部分胚珠無(wú)法受精形成胚胎。
2.RLI2功能喪失會(huì)損害花粉管的萌發(fā)，RLI2定位顯示同時(shí)存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中
研究采用Alexender染色檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)活力，DAPI染色檢測(cè)核結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察花粉形態(tài)，觀察結(jié)果顯示rli2-1/+的花粉發(fā)育與野生型相當(dāng)，但是rli2-1/+的花粉萌發(fā)率顯著低于野生型，將花粉管標(biāo)記物pLat52：：GUS四聯(lián)體1（qrt1）43、44導(dǎo)入rli2-1/+對(duì)花粉管進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明RLI2功能的喪失導(dǎo)致了體內(nèi)花粉管生長(zhǎng)的缺陷，只有誘導(dǎo)部分花粉產(chǎn)生花粉管進(jìn)入胚珠。
研究對(duì)擬南芥不同部位進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)RLI2表達(dá)量，RLI2在生殖組織中廣泛表達(dá)；pRLI2：：GUS的轉(zhuǎn)基因植株；pRLI2：：H2B-GFP的轉(zhuǎn)基因植物；檢測(cè)了RLI2在生殖生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)情況，在胚珠、胚珠和花粉中均有高水平的表達(dá)；將pRLI2：：RLI2-GFP載體導(dǎo)入rli2-1/+植株中，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均檢測(cè)到GFP信號(hào)，與核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，綜上，RLI2同時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。
3.沉默RLI2會(huì)導(dǎo)致擬南芥發(fā)育過(guò)程中多種缺陷
對(duì)rli2-1/+植株進(jìn)行pUBQ10：：RNAi-RLI2處理，構(gòu)建出的轉(zhuǎn)基因植株在各種組織中都表現(xiàn)出缺陷，如葉片較小、矮化和結(jié)實(shí)率。這些植株的未受精率顯著提高，且呈現(xiàn)出異常的胚囊，pES1：：H2B-GFP RNAi-RLI2植株的胚珠僅顯示出一個(gè)細(xì)胞核或一個(gè)降解的胚囊，結(jié)果表明：RNAi-RLI2植株的結(jié)實(shí)率減少是由于胚囊不受精導(dǎo)致的。定量結(jié)果顯示，RNAi-RLI2中RLI2的轉(zhuǎn)錄水平低于野生型植株，綜上結(jié)果表明，RLI2的敲除導(dǎo)致了擬南芥的多效性發(fā)育缺陷。
4.RLI基因的系統(tǒng)發(fā)育分析
研究利用公開數(shù)據(jù)庫(kù)，將AtRLI2的氨基酸序列與其他物種的RLI/ABCE序列，包括真核生物和原核生物進(jìn)行了比較；系統(tǒng)發(fā)育分析表明，AtRLI2與甘藍(lán)型油菜（基因庫(kù)：XP_013678613）的同源性為97.7%，與雙子葉和單子葉植物的同源性為96%-92%；在某些物種中，RLI/ABCE家族由兩個(gè)成員組成，這表明在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了RLI/ABCE基因的復(fù)制，為了確定動(dòng)物和真菌中的RLIs是否也在植物中發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)將MmRLI1（GenBank：NP_056566）和ScRLI1（YDR091C）引入到擬南芥RLI2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的rli2-1/+植物中。結(jié)果表明，pRLI2：：MmRLI1和pRLI2：：ScRLI1的種子植株與rli2-1/+突變體沒(méi)有顯著差異；我們將AtRLI1和AtRLI2分別導(dǎo)入到ScRLI1缺失的酵母中，研究擬南芥RLI基因是否可以取代ScRLI1基因的功能（圖S5E和S5F）。結(jié)果顯示，外源性的AtRLI1和AtRLI2不能挽救致死表型，而ScRLI1可以挽救致死表型（圖S5F），說(shuō)明AtRLIs不能取代ScRLI1的功能。擬南芥rli1基因和ScRLI1基因不能相互替代。
5.敲除RLI2影響翻譯機(jī)制的組裝及翻譯效率
RLI/ABCE蛋白亞家族在ABC蛋白的進(jìn)化分析中最保守，RLI參與了多種翻譯過(guò)程；研究進(jìn)行了雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，選擇擬南芥eIF3的4個(gè)亞基進(jìn)行研究；通過(guò)免疫從沉淀（co-IP）驗(yàn)證eIF蛋白與細(xì)胞質(zhì)中RLI2存在相互作用，歷史研究顯示RLI2也與核糖體形成和生物發(fā)生因子相關(guān)，表明RLI2參與了多個(gè)翻譯過(guò)程。使用WB分析RLI2蛋白，結(jié)果顯示RLI2蛋白會(huì)出現(xiàn)在40S、60S和80S的核糖體組分中，而不出現(xiàn)在多聚體組分中，表明RLI2與核糖體相關(guān)，且對(duì)RNAi-RLI2植物進(jìn)行了多聚體分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，40S、60S和80S核糖體亞基的豐度明顯減少。綜上RLI2通過(guò)與翻譯相關(guān)因子相互作用，參與了翻譯機(jī)制的組裝。
研究使用l-疊氮同型丙氨酸（Click-iT AHA）標(biāo)記檢測(cè)了野生型和RNAi-RLI2植株中新生蛋白的相對(duì)水平，該標(biāo)記與Cy5反應(yīng)，RNAi-RLI2植株中Cy5熒光的相對(duì)水平顯著降低即新產(chǎn)生的蛋白豐度限制降低。對(duì)野生型和RNAi-RLI2植株進(jìn)行4D蛋白組和轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)分析，進(jìn)行kegg和go數(shù)據(jù)庫(kù)注釋和富集分析，富集到了與植物生長(zhǎng)的相關(guān)通路（核糖體結(jié)構(gòu)成分、糖酵解過(guò)程、核小體組裝等）。并基于蛋白組數(shù)據(jù)使用免疫熒光異丙酯脫氫酶1（IPMDH1）和胚胎缺陷3147（EMB3147）蛋白的水平，上述蛋白在RNAi-RLI2中的水平顯著降低。綜上表明，RLI2基因敲除會(huì)導(dǎo)致翻譯效率降低。
6.敲除RLI2會(huì)干擾生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)
RNA-seq分析了RNAi-RLI2植株的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)變化，kegg通路分析顯示，在RNAi-RLI2幼苗中植物繼續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路、晝夜節(jié)律等重要信號(hào)顯著富集，上述結(jié)果表明，RLI2在多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮作用。GO富集結(jié)果顯示，生長(zhǎng)素生物合成過(guò)程（GO：0009851）、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)（GO：0060918）和對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)（GO：000 9733），在下調(diào)基因中顯著富集；綜上數(shù)據(jù)表明RLI2會(huì)影響生長(zhǎng)素信號(hào)通路。生長(zhǎng)素在胚胎發(fā)育中起著重要的作用，是唯一一種從受精到種子成熟期間保持高水平的植物激素。檢測(cè)了生長(zhǎng)素反應(yīng)報(bào)告基因DR5：：V2-GFP在野生型中的表達(dá)，結(jié)果表明，RLI2在早期胚胎發(fā)生的頂端-基底模式形成過(guò)程中調(diào)控生長(zhǎng)素的分布。
進(jìn)一步通過(guò)蛋白組數(shù)據(jù)證實(shí)RNAi-RLI2植物中生長(zhǎng)素信號(hào)通路受損；MP/ARF5蛋白水平降低，ARF5是胚胎和幼苗發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子；將pMP：：MP-GFP引入RNAi-RLI2植物中。與野生型相比，RNAi-RLI2中的MP-GFP信號(hào)和蛋白水平顯著降低；綜上結(jié)果表示，RLI2通過(guò)調(diào)節(jié)MP的翻譯效率來(lái)影響生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)。
生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN7調(diào)控胚胎和幼苗的發(fā)育，與野生型相比，RNAi-RLI2中的PIN7-GFP信號(hào)和蛋白水平顯著降低。RLI2也會(huì)調(diào)控PIN7的翻譯效率，從而影響生長(zhǎng)素的極性轉(zhuǎn)運(yùn)，且植物激素相關(guān)的基因在上調(diào)基因中顯著富集，綜上結(jié)果表明，RLI2的敲除干擾了擬南芥的植物激素穩(wěn)態(tài)。
參與生長(zhǎng)素信號(hào)通路的基因在RLI2敲除和hot3-2突變體中均有差異表達(dá)：分析了RNAi-RLI2和eIF5B突變體hot3-2中差異表達(dá)的基因存在重疊，KEGG分析富集到植物激素與代謝相關(guān)的通路，在RNAi-RLI2和hot3-2中的誘導(dǎo)表明，RLI2和eIF在植物激素穩(wěn)態(tài)中具有相似的功能。這些結(jié)果表明，RLI2與eIFs相互作用，調(diào)節(jié)下游植物激素信號(hào)，特別是生長(zhǎng)素信號(hào)，正向調(diào)控植物生長(zhǎng)。
?結(jié)果討論?Origingene
RLI2與eIFs、核糖體形成和生物發(fā)生因子以及翻譯釋放因子相互作用，參與翻譯機(jī)制的組裝，以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育；敲除RLI2明顯降低了40S、60S和80S核糖體單體和多聚體的豐度，通過(guò)蛋白質(zhì)組分析確定，RLI2的敲除導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯效率的改變，特別是核糖體蛋白。RLI2的敲除導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)缺陷，即RLI2會(huì)在植物生長(zhǎng)發(fā)育的其他過(guò)程中影響花粉和植物的功能。
擬南芥中的RLI家族（RLI1、RLI2）主要在生殖組織中表達(dá)，定量結(jié)果顯示RLI1的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于RLI2，說(shuō)明RLI2可能在植物的生殖發(fā)育中沒(méi)有發(fā)揮主導(dǎo)作用。ABCE/RLI被研究最廣泛的功能是它參與翻譯過(guò)程。在果蠅和酵母中存在功能類似的同源基因（Pixie、ScRLI1）,敲除ABCE1會(huì)顯著改變酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物中多聚體的豐度；本研究中敲除RLI2也會(huì)導(dǎo)致核糖體單體的豐度降低。RLI2與eIFs、核糖體形成、生物發(fā)生因子（RPL23aB和RPS2B）和釋放因子（ERF1-1、ERF1-2、ERF1-3和EF1a）相互作用，在多個(gè)翻譯過(guò)程中發(fā)揮作用，從而影響擬南芥的翻譯效率。
ABCE蛋白在植物和人類中也會(huì)作為RNA沉默的內(nèi)源性抑制因子，ABCE1與RNase L特異性形成異二聚體，抑制其與2-5A的結(jié)合。組學(xué)分析結(jié)果顯示，野生型與RNAi-RLI2中與胚胎和花粉萌發(fā)相關(guān)的蛋白的富集程度有很大的區(qū)別，表明RLI2影響這些蛋白的翻譯效率，調(diào)控胚胎發(fā)育和花粉萌發(fā)。RNAi-RLI2植株的生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)，對(duì)翻譯受損突變株系進(jìn)行生長(zhǎng)素信號(hào)檢測(cè)，結(jié)果顯示生長(zhǎng)素信號(hào)的抑制是翻譯機(jī)制受損突變體的共同特征。
結(jié)合蛋白組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出其他與擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的基因（AKRP、AACT2、AtNAP7、ABCB19），上述蛋白豐度的降低可能導(dǎo)致了RLI2突變體中相應(yīng)的發(fā)育缺陷。
敲除RLI2導(dǎo)致全球40S、60S和80S核糖體亞基豐度下降，導(dǎo)致核糖體不足，從而影響核糖體組裝，這可能是翻譯效率降低的原因。綜上，我們的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了核糖體組裝和翻譯調(diào)控在配子體發(fā)育和胚胎發(fā)生中的重要性。
參考文獻(xiàn)
Yu, Shi-Xia et al. “RLI2 regulates Arabidopsis female gametophyte and embryo development by facilitating the assembly of the translational machinery.” Cell reports, vol. 42,7 112741. 6 Jul. 2023, doi:10.1016/j.celrep.2023.112741
