題目

High expression of ACE2 receptor of 2019-nCoV on the epithelial cells of oral mucosa

摘要

據(jù)報道，ACE2是2019年nCoV的主要宿主細胞受體，在病毒進入細胞引起最終感染中起著至關重要的作用。要研究口腔黏膜上2019-nCov感染的潛在途徑，來自兩個公共數(shù)據(jù)庫的大量RNA-seq配置文件，包括癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因表達功能注釋（FANTOM5 CAGE）收集數(shù)據(jù)集。為了分析和驗證ACE2在口腔粘膜中的表達，分析了TCGA的13種癌旁正常組織和FANTOM5 CAGE的14種正常組織的RNA-seq分析數(shù)據(jù)。此外，來自內(nèi)部產(chǎn)生的獨立數(shù)據(jù)的單細胞轉(zhuǎn)錄組被用于鑒定和確認表達ACE2的細胞組成及其在口腔中的比例。結(jié)果表明，ACE2在口腔粘膜上表達。有趣的是，該受體在舌頭的上皮細胞中高度富集。最初，這些發(fā)現(xiàn)解釋了口腔是2019-nCoV感染易感性潛在高風險的基本機制，并為牙科臨床實踐以及日常生活中的未來預防策略提供了證據(jù)。

方法和材料

公開數(shù)據(jù)集的獲取和分析

從癌癥基因組圖譜（TCGA; https://www.cancer.gov/tcga）下載。將RNA-seq數(shù)據(jù)進行批量效應歸一化，并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換以用于后續(xù)分析。

內(nèi)部隊列的口腔組織

由于我們先前有關口腔潛在惡性疾病的研究，在獲得四川大學華西口腔醫(yī)院的知情同意并獲得倫理學批準后，從患者那里獲得了口腔粘膜的四個組織。

新鮮活檢組織分離

新鮮的活檢組織用D-PBS（Hyclone）洗滌兩次，并收集到預冷的MACS組織存儲溶液（Miltenyi）中。 使用全皮膚分離試劑盒人類（Miltenyi）制造商指南從活檢組織中產(chǎn)生單細胞懸液，并用70μmMACS Smartstrainers（Miltenyi）過濾。 通過紅細胞裂解緩沖液（Abcam）裂解殘留的紅細胞，并通過Easysep死細胞去除（Annexin V）試劑盒（STEMCELL）去除死細胞。 最后，將細胞沉淀重懸于D-PBS中。

單細胞RNA測序

為了生成單細胞乳液中的凝膠珠（GEM），使用10x鉻平臺捕獲細胞并對其進行條形碼處理。 將細胞與涂有寡核苷酸的凝膠珠一起分配到GEM中，并擴增帶有兩個條形碼的cDNA，并使用10x Genomics Chromium Single Cell Kit（v3 chemistry）為每個樣品構建文庫。 將所得文庫在Illumina NovaSeq 6000系統(tǒng)上測序。

單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)預處理和分析

FASTQ文件使用Cell Ranger軟件套件（版本3.1； 10x Genomics）進行了分析。 使用Seurat（3.0版）讀取四個組織的基因條形碼矩陣。 為了控制質(zhì)量，我們刪除了<200個基因和500個UMI計數(shù)的細胞，以及線粒體含量高于5％的細胞。 此外，濾出了<3個細胞中檢測到的基因。 使用Seurat中的“ sctransform”包裝器對數(shù)據(jù)進行規(guī)范化并消除混雜的變異源，“ IntegrateData”用于整合來自四個組織的Seurat對象。 使用統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）進行降維和對單元進行聚類，并根據(jù)其規(guī)范標記分配單元類型。 用Seurat在R中生成UMAP圖，熱圖和小提琴圖。

結(jié)果

image.png

圖1。a TCGA癌旁正常組織中ACE2表達的小提琴圖。 b FANTOM5 CAGE數(shù)據(jù)集中正常組織中ACE2表達的條形圖。 c TCGA在不同口腔部位的癌旁正常組織中ACE2表達的條形圖； d TCGA兩種口腔部位中ACE2的箱線圖

image.png

圖2來自獨立數(shù)據(jù)集的口腔組織的單細胞RNA-seq分析。 通過細胞標記鑒定出七種細胞類型； 細胞通過UMAP方法聚類。 b用于識別細胞類型的細胞標記物的熱圖。 c具有ACE2表達的所有細胞的散點圖。 d不同口腔部位ACE2表達的小提琴圖。 跨不同細胞類型的ACE2表達的小提琴圖。 f帶有ACE2表達的舌上皮細胞的散點圖