1、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：fastqc軟件
1）使用方法：/life/rjian/software/fastQC/FastQC/fastqc -o/life/rjian/data/liyan/filename_fastqc\filename.fq >>filename.log
2）參數(shù)說明：-o:輸出文件所在目錄，并且是已經(jīng)存在的目錄,如：filename_fastqc
--noextract:不解壓縮輸出文件
最后加上fastq文件：filename.fq;重定向結(jié)果到日志文件：filename.log,以便查看。
filename:表示是一個樣品的一個生物學(xué)重復(fù),一般有多個樣品，每個樣品有多個重復(fù)，如：C1_R1;如果是雙端測序則后面會加上數(shù)字，如：filename_1.fq和filename_2.fq
2、readstrim工具——trimmomatic
1)使用方法：java -jar/life/rjian/software/Trimmomatic-0.32/trimmomatic-0.32.jar SE-threads 5 \-phred33 -trimlog filename_trimmomatic.log filename.fqfilename_out.fq ILLUMINACLIP:adapter.fa:2:30:10 \SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36
2)參數(shù)說明：SE：指定單端測序，PE：雙端測序
-threads:指定線程數(shù)
-phred33:指定fastq文件的質(zhì)量格式，或者：-phred64
-trimlog:指定日志文件，后加上輸入和輸出文件
ILLUMINACLIP:adapter.fa:2:30:10：adapter.fa為adapter文件，2:允許的最大mismatch數(shù)，30:palindrome模式下匹配堿基數(shù)閾值,10:simple模式下的匹配堿基數(shù)閾值
SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36:滑動窗口的size是4個堿基，其平均堿基質(zhì)量小于15，則切除。
MINLEN:36：最低reads長度為36
3、bowtie2建立參考基因組的索引——bowtie2-build
1）使用方法： bowtie2-build<要生成的索引文件前綴名>；比如：
nohup/home/cuckoo/software/bowtie2-2.2.3/bowtie2-build genome.fabowtie2index/genome>>bowtie2.log &
2）參數(shù)說明：genome.fa是fasta文件；
genome是要生成的索引文件的前綴名；
bowtie2index是一個文件夾，用來存放索引文件，方便日后查看和使用；
注意：程序運(yùn)行完后genome.fa文件要放在bowtie2index索引目錄中，tophat2軟件才能正確運(yùn)行。
4、reads mapping到參考基因組——tophat2軟件：基于bowtie2
1）使用方法：/home/cuckoo/software/tophat-2.0.12.Linux_x86_64/tophat2-p 8 -G \/home/cuckoo/data/liyan/train/genes.gtf -o filename_thout/\/home/cuckoo/data/liyan/train/bowtie2index/genome/home/cuckoo/data/liyan/train/filename.fq\>filenametophat.log
2）參數(shù)說明：-p ：指定線程數(shù)，默認(rèn)為1
-G ：指定已有的基因組注釋信息，gtf或gff文件；
-o ：指定輸出目錄，默認(rèn)為”./tophat_out“；
后面加上索引文件：與前面的bowtie2建立的索引相對應(yīng)，只取前綴名。
最后加上fastq文件：filename.fq；如果是雙端測序則是filename_1.fq和filename_2.fq兩個文件。
5、轉(zhuǎn)錄本組裝——Cufflinks：Cufflinks是一套拼接轉(zhuǎn)錄本，定量表達(dá)量。
1）使用方法：/home/cuckoo/software/RNAseq/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64/cufflinks-p 8 -o \filename_clout filename_thout/accepted_hits.bam>filename_cufflinks.log
2）參數(shù)說明：-p ：指定線程數(shù)；
-o ：指定輸出文件所在目錄；
后面跟上Tophat2中生成的bam文件：
6、轉(zhuǎn)錄本合并——Cuffmerge
1）使用方法：/home/cuckoo/software/RNAseq/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64/cuffmerge-g genes.gtf -s\/home/cuckoo/data/liyan/train/bowtie2index/genome.fa -p 8assemblies.txt
2）參數(shù)說明：-g ：參考基因組注釋文件
-s ：參考基因組序列文件
-p ：指定線程數(shù)
-o ：指定輸出文件merged.gtf所在目錄，默認(rèn)情況下是 merged_asm
最后assemblies.txt：一個包含每個樣品（重復(fù)）拼接后的gtf文件的列表；如下：兩個文件分別是在上一步中生成的樣品的轉(zhuǎn)錄本注釋文件。
./s0924fb_clout/transcripts.gtf
./sCal27_clout/transcripts.gtf
7、基因和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量——cuffquant
1）使用方法：/home/cuckoo/software/RNAseq/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64/cuffquant-o sample_quant -p 8 \-u AT.gffsample_thout/accepted_hits.bam
2）參數(shù)說明：-o：指定結(jié)果輸出目錄：包含結(jié)果文件abundances.cxb
-p ：指定線程數(shù)
-u ：指定對比對上基因組上多個位置的reads進(jìn)行統(tǒng)計分析。
加上參考基因組注釋文件：AT.gff
最后加上Tophat2產(chǎn)生的該樣本的比對結(jié)果文件：accepted_hits.bam
8、基因和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化——cuffnorm
1）使用方法：/home/cuckoo/software/RNAseq/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64/cuffnorm-o cuffnorm_out -p 8 \-L 0h_1,12h_CK1,12h_E1 AT.gff/data/disk2/liyan/AT/0h_1_quant/abundances.cxb\/data/disk2/liyan/AT/12h_CK1_quant/abundances.cxb/data/disk2/liyan/AT/12h_E1_quant/abundances.cxb
2）參數(shù)說明：-o ：指定結(jié)果輸出目錄
-p ：指定線程數(shù)
-L ：為每個樣本（處理）作標(biāo)記
–total-hits-norm ：計算所有的fragments，包括與所有的參考轉(zhuǎn)錄本不容的，默認(rèn)不激活。
–compatible-hits-norm ：只計算與一些參考轉(zhuǎn)錄本相容的fragments,默認(rèn)激活。
加上參考基因組注釋文件：AT.gff
最后加上每個樣本（處理）的cuffquant產(chǎn)生的abundances.cxb文件，樣本的每個重復(fù)之間用逗號”，“分割；樣本之間則由空格分割。
9、轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)分析——Cuffdiff：分析差異表達(dá)基因的工具。
1）使用方法：/home/cuckoo/software/RNAseq/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64/cuffdiff-o diff_out -b \bowtie2index/genome.fa -p 8 -L C1,C2 -umerged_asm/merged.gtf ./C1_thout/accepted_hits.bam\./C2_thout/accepted_hits.bam
2）參數(shù)說明：-o ：指定輸出目錄
-b ：參考基因組序列文件
-p ：指定線程數(shù)
-L ：為每個樣本標(biāo)上名稱-u：-u命令指cuffdiff對回帖的基因組中多個位置的read進(jìn)行一個初步的估計，然后加權(quán)分配到各個基因組位置。而不是簡單的平均分配，其功能與Cufflinks中的u命令相同。
加上合并后的轉(zhuǎn)錄本：merged.gtf;由cuffmerge產(chǎn)生。
最后是TopHat產(chǎn)生的樣本的bam文件，如果一個樣本有多個生物學(xué)重復(fù)，那么我們需要提供每個重復(fù)的bam文件，文件名之間以逗號隔開并且樣本名應(yīng)與-L參數(shù)相對應(yīng)。
10、轉(zhuǎn)錄本與參考基因組注釋文件比較——Cuffcompare，發(fā)現(xiàn)新基因，轉(zhuǎn)錄本
1）使用方法：cuffcompare -i gtf_out_list.txt -r genes.gtf
2）參數(shù)說明：-i ：輸入文件，是cufflinks組裝轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果文件——transcripts.gtf的列表；
其中g(shù)tf_out_list.txt是由find . -name transcripts.gtf> gtf_out_list.txt命令產(chǎn)生的集合了所有樣本轉(zhuǎn)錄本文件的列表。
-o ：指定輸出文件的前綴，如果沒有指定默認(rèn)為cuffcmp。
-r ：指定參考基因組注釋文件。
注：結(jié)果文件大部分位于cmp_out（自己先建立好）目錄中，統(tǒng)計匯總所有轉(zhuǎn)錄本的比較情況；而單個樣本轉(zhuǎn)錄本的比較結(jié)果文件：cuffcmp.transcripts.gtf.tmap和 cuffcmp.transcripts.gtf.refmap分別位于樣本的cufflinks運(yùn)行結(jié)果transcripts.gtf所在目錄中，統(tǒng)計單個樣本的比較情況以鑒定新轉(zhuǎn)錄本。
