跨物種單細胞測序發(fā)現(xiàn)了一類具有抗原提呈作用的腫瘤相關(guān)成纖維細胞（apCAF）。
該文章在2019年發(fā)表于Cancer discovery，影響因子29.497，作者為冷泉港實驗室腫瘤中心主任David Tuveson教授。
該課題組建立了大量人類腫瘤類器官和3D培養(yǎng)模型來探索癌癥發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制，如研究胰腺癌氧化還原穩(wěn)態(tài)，癌基因Ras的信號傳導(dǎo)過程，旨在發(fā)現(xiàn)胰腺癌的早期診斷標志物，并確定胰腺癌細胞和腫瘤基質(zhì)細胞之間的交互作用機制。
在腫瘤高分領(lǐng)域單細胞測序滿天飛的當下，作者發(fā)現(xiàn)了新的CAF亞群并通過功能驗證成功蹭到腫瘤免疫的熱點，為靶向藥物研發(fā)以及個體化治療提供了新的思路。
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研究背景
胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）病死率高、預(yù)后較差，對常規(guī)治療應(yīng)答不良，其特征在于以CAF為代表的大量非惡性基質(zhì)細胞。早期人們發(fā)現(xiàn)了tumor-promoting CAF，而敲除小鼠體內(nèi)的CAFs則促進腫瘤轉(zhuǎn)移。
作者前期發(fā)現(xiàn)了炎癥性iCAF和肌纖維母細胞的myCAF，為了進一步研究PDAC的異質(zhì)性，課題組通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了一類表達MHC class II和CD74的新CAF亞群，并將其命名為apCAF（antigen-presenting CAFs）。
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思路模塊
正文共7組圖，可分為三個部分。第一部分為人源PDAC基質(zhì)細胞和CAFs亞群描述（Fig.13）。第二部分是在小鼠和人源組織中發(fā)現(xiàn)apCAF并進行鑒定（Fig.46）。第三部分是通過小鼠模型進行新亞群apCAF的功能驗證（Fig.7）。
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數(shù)據(jù)解讀
課題組收集了6例PDAC組織和2例癌旁對照，共計21,200個細胞。通過流式分選了CAFs和非CAFs的細胞群（圖1A），然后進行t-SNE降維處理得到15個細胞群，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞以髓樣和淋巴樣為主（圖1B），進一步展示了每類細胞對應(yīng)的特異標志物(平均5246個轉(zhuǎn)錄本，1576個基因；圖1C)。
在人源PDAC組織中鑒定出四群胰管細胞, 其中第2群來源于正常組織,其它3群主要來源于腫瘤組織（圖1DE）。圖1F展示了每群胰管細胞對應(yīng)的特異標志物。通路分析(1,3,4群vs2群) 富集到KRAS，p53和hypoxia pathway，符合腫瘤特征。
Fig.2 免疫抑制微環(huán)境在人源PDAC中具有重要作用
在髓樣細胞中進行降維處理后發(fā)現(xiàn)了一些以單核巨噬為主的細胞群（圖2A），其中第4群（替代性活化的巨噬細胞）全部來源于腫瘤組織，且高表達免疫抑制因子，如SPP1, LY6E, MARCO（圖2BC）。進一步發(fā)現(xiàn)單核巨噬細胞表達粒細胞標志物，提示髓樣細胞具有高度異質(zhì)性（圖2D）。
在T 和NK細胞中通過降維處理發(fā)現(xiàn)5個細胞群，以T細胞為主，其中第3群（Treg）全部來源于腫瘤組織 且高表達以CTLA4和TIGIT為代表的免疫抑制因子，此外檢測到T/NK細胞耗竭標志物，提示參與免疫抑制（圖2E~H）。
Fig.3 在人源PDAC組織中檢測到不同的CAFs亞群（前期工作驗證）。
作者分析了962個CAFs的相關(guān)標志物通過降維處理后發(fā)現(xiàn)了兩個細胞亞群即iCAFs和myCAFs（圖3AB）。
Pan-CAF特異性表達COL1A1，F(xiàn)AP，PDPN，DCN和VIM（圖3C）；iCAFs高表達炎癥和趨化因子如CXCLs, CCLs；myCAFs高表達aSMA(ACTA2)等標志物（圖3DE）。
進一步分析CAFs內(nèi)異常激活的分子發(fā)現(xiàn)iCAFs的差異表達分子如IL1R1和STAT3，myCAFs的差異表達分子如TGFBI和SMAD2 (圖3F~I) 。
Fig.4 在KPC小鼠PDAC組織中發(fā)現(xiàn)新的CAFs亞群（apCAF）。
作者構(gòu)建了4只KPC小鼠并獲取了11,260個細胞，t-SNE降維處理后得到12個細胞群，其基質(zhì)細胞以巨噬和中性粒為主（圖4A）。
圖B展示了每類細胞對應(yīng)的特異標志物(平均5989個轉(zhuǎn)錄本，1916個基因)。在4012個CAFs中發(fā)現(xiàn)三個亞群即iCAF，apCAF和myCAF，其中apCAF異常激活的分子H2-Ab1和Cd74編碼MHC-II（圖4C~H）。
表1 CAF細胞亞群特異標志物
Fig.5 在KPC小鼠組織中鑒定出新的CAFs亞群（apCAF）
在圖5A~D中作者通過RNA原位雜交檢測到Col1a1(pan-CAF marker)和H2?Ab1 (apCAF)，IHC檢測到PDPN(pan-CAF marker)和CD74(apCAF)，流式分選到三個CAF亞群（iCAF，apCAF和myCAF）。
其中apCAF高表達H2?Ab1，Cd74， Slpi ，Saa3（圖5E），iCAF高表達Cxcl12，Pi16，Il6（圖5F）；myCAF高表達Acta2，Tgfb1，驗證了前期測序結(jié)果（圖5G）。
Fig.6 在人源PDAC組織中鑒定出新的CAFs亞群（apCAF）
作者檢測了人源CAFs表達編碼MHCII的基因HLA-DRA，HLA-DPA1和HLA-DQA1，pan-CAF marker Col1a1，mouse apCAF marker CD74、SLPi，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20.9% human CAFs同時表達CD74和HLA-DRA（圖A~C）。
在圖D中通過Imaging mass cytometry檢測到人源PDAC組織中的pan-CAF marker Col1a1（綠色） ，apCAF marker CD74和HLA-DR（白色）；同時不表達CD45（紅色）或EPCAM（紫色）。
Fig.7 apCAF提呈抗原激活CD4+T
對KPC小鼠2-D培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其apCAF丟失MHCII相關(guān)markers，而獲得myCAF markers，提示CAFs發(fā)生了亞群轉(zhuǎn)化（圖7A）。
在T細胞激活實驗中作者制備了原位類器官KPC小鼠模型用于分選CAFs和APCs，另制備OVA特異性激活的TCR小鼠模型，分選CD4+T并進行共培養(yǎng)，流式檢測細胞共培養(yǎng)結(jié)果（圖7BC）。
APCs+OVA組能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的CD69+T cell，apCAF+OVA組類似，但效果低于前者，但myCAF或iCAF無法激活T細胞（圖7D）。apCAF、myCAF和iCAF均不表達協(xié)同刺激分子，提示與傳統(tǒng)APC激活T的機制略有差別（圖7E）。
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文章小結(jié)
跨物種單細胞測序發(fā)現(xiàn)了具有抗原提呈作用的腫瘤相關(guān)成纖維細胞，其主要技術(shù)路線包括臨床樣本→單細胞RNAseq→數(shù)據(jù)建庫→表達矩陣→降維策略→類的注釋→下游分析。
作者主要發(fā)現(xiàn)了新的亞群apCAF及其標志物；apCAF具有抗原提呈功能；CAFs亞群之間的演化。對于apCAF介導(dǎo)腫瘤免疫的內(nèi)在機制以及靶向CAFs亞群的個體化治療方案仍然是未知的探索方向。
近年來僅靠單細胞測序發(fā)表高水平文章的數(shù)量逐年減少，科學(xué)家們逐漸將測序工作與后續(xù)的功能驗證相結(jié)合。如能提供空間轉(zhuǎn)錄組信息分析細胞亞群之間的定位結(jié)果則會為相關(guān)功能的研究奠定更為扎實的科學(xué)基礎(chǔ)。
單細胞測序發(fā)上30分的靠譜路線_apCAF
