原理

乳酸脫氫酶（LDH）是一種氧化還原酶，可催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化以及NADH和NAD+的相互轉(zhuǎn)化。LDH是一種穩(wěn)定的酶，存在于所有細胞類型中，并在質(zhì)膜受損后迅速釋放到細胞培養(yǎng)基中。因此，LDH是細胞毒性研究中使用最廣泛的標記。細胞毒性檢測試劑盒（乳酸脫氫酶法）為研究細胞毒性提供了一種簡便的比色測定法。該測定基于在典型的細胞毒性測定中，將靶細胞與細胞毒性化學試劑或細胞毒性細胞（NK細胞，細胞毒性T細胞）一起培養(yǎng)，以誘導靶細胞死亡和LDH釋放。將含有LDH的上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔測定板的孔中，并與LDH Reaction Solution混合。在LDH的作用下，NADH和四唑鹽MTT反應生成NAD+ 和MTT的還原形式,該MTT的還原形式在565 nm處表現(xiàn)出最大吸收，產(chǎn)生的顏色強度與裂解的細胞數(shù)直接相關(guān)。在室溫下孵育30分鐘后，使用酶標儀讀取565 nm的吸光度。

自備耗材

·酶標儀（能測565 nm處的吸光度）及二氧化碳培養(yǎng)箱

·96孔板，透明平底

·平板離心機（可選）

·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭

·去離子水

實驗步驟

A確定藥物是否適用該試劑盒

個別藥物可能會干擾反應體系，故不適用于該試劑盒，因此，我們建議執(zhí)行初始預實驗，以確定計劃使用的目標藥物是否適用于該試劑盒，如果預實驗顯示藥物有抑制作用，聯(lián)系Abbkine技術(shù)支持。

1.?培養(yǎng)細胞24 h以上，離心除去顆粒，得到細胞培養(yǎng)上清。

2.?將細胞培養(yǎng)上清加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，200 μL/孔，設置6個復孔。

3.?在3個孔中加入20 μL目標藥物，另外3孔加入20 μL Assay Buffer作為對照孔。

4.?每孔各取100 μL轉(zhuǎn)移到新的96孔檢測板中。

5.?每孔加入100 μL LDH Reaction Solution。

6.?將板在37℃下孵育最多30 min。

7.?用酶標儀讀取565 nm處的吸光度。

8.?評估加藥孔與對照孔的吸光度，若加藥孔明顯小于對照孔，說明該藥物不適用于該試劑盒。

B樣本測定

1.?根據(jù)細胞的大小和生長速度確定最佳濃度，將200 μL細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，使待檢測時細胞密度不超過80-90%。

2.?從96孔板中吸出生長培養(yǎng)基。用PBS洗滌細胞一次，然后將生長培養(yǎng)基替換為含1%血清的低血清培養(yǎng)基，再孵育1 h。

3.?將200 μL 1%低血清培養(yǎng)基（無細胞）添加至三個孔作為背景對照和三個孔作為LDH陽性對照（可選做）。

4.?通過所需方法誘導細胞毒性，向適當?shù)目字幸皇饺萏砑?0μL藥物。將20 μL的10% Triton X-100溶液添加到三個含有細胞的孔中作為最大釋放。將20 μL Assay Buffer添加到三個含有細胞的孔中作為自發(fā)釋放，同時將20 μL Assay Buffer添加到三個只含1%低血清培養(yǎng)基無細胞的孔中作為背景對照。將20 μL LDH Positive Control添加到三個只含1%低血清培養(yǎng)基無細胞的孔中作為陽性對照。

5.?在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育平板，使其達到實驗所需的的時間。

6.?以400 g的速度離心96孔組織培養(yǎng)板5 min（可選做，但建議做）。

7.?將100 μL細胞上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔測定板中。

8.?向每個孔中添加100 μL LDH Reaction Solution。

9.?在37℃下孵育平板最多30 min。

10.?用酶標儀讀取565 nm處的吸光度。

11.?從所有孔中減去背景A565水平。

注意：加入藥物濃度應是反應體系的終濃度。每個實驗的結(jié)果計算為“細胞毒性百分比”，或靶細胞中所含LDH總量的百分比。 因此，對于每個實驗，必須有一組對照孔，其中使用試劑盒中提供的10% Triton X-100溶液殺死所有靶細胞。 這些就是“最大釋放量”。同樣，在每個實驗中，必須有一組對照孔，其中未添加細胞毒性劑或細胞毒性細胞，從而導致最低的（自發(fā)的）LDH釋放，就是“自發(fā)釋放”細胞孔。 用細胞毒劑處理的細胞將釋放一定數(shù)量的LDH，該數(shù)量介于最大釋放水平和自發(fā)釋放水平之間。

結(jié)果計算

以下公式計算為“細胞毒性百分比”

細胞毒性百分比?(%) =(A樣本－A自發(fā)) / (A最大釋放－A自發(fā))×100

A樣本，毒性試劑處理樣本在565 nm處的吸光度；A自發(fā)，樣本在565 nm處自發(fā)釋放的吸光度；A最大釋放，樣本在565 nm處最大釋放的吸光度。

注意事項

1.?不同批次號、不同的廠家的組分不要混用；否則，可能導致結(jié)果異常。

2.?混合或復溶組分時，避免產(chǎn)生氣泡。

3.?勤換吸頭，避免各組分之間的交叉污染。

4.?實驗開始前，確保所有的組分及設備處于合適的溫度。

5.?保持好的實驗習慣，穿戴好手套、實驗服、口罩、防目鏡等防護工具后再開始實驗。